Практична частина:

Мета роботи: Засвоїти метод визначення концентрації сечовини в крові людини за кольоровою реакцією з диацетилмоноксимом.

Контрольні питання.

1. Роз'ясніть поняття: ДНК-полімераза, ДНК-праймаза, ДНК-топоізомераза, ДНК-геліказа, дестабілізуючі білки.

2. Будова реплікативної вилки.

3. Дати визначення промотору, старт-сигналу, стоп-сигналу, консенсусним послідовностям.

4. Зобразіть схему синтезу РНК.

5. Будова т-РНК: люцерновий листок та L-конформація.

6. Намалюйте та поясніть схему утворення аміноацил-тРНК. Яким чином кожна з амінокислот приєднується до відповідної їй молекули тРНК?

7. Будова рибосоми.

8. Етапи трансляції: ініціація, елонгація та термінація.

Практичне значення роботи: Визначення сечовини є важливим діагностичним тестом, що характеризує не тільки стан білкового обміну, але і функціональний стан нирок і печінки. Підвищення концентрації сечовини в крові відзначається при порушенні видільної функції нирок, при посиленому розпаді білків, надлишковому білковому харчуванні. Зниження рівня сечовини в крові і виділення її із сечею спостерігається при захворюванні печінки (цироз), що пов'язано з порушенням її сечовиноутворюючої функції.

Принцип методу. Диацетилмоноксим у кислих умовах гідролізується до диацетила, що реагує із сечовиною з утворенням пофарбованого в червоно-рожевий колір комплекс, що має максимум поглинання при довжині хвилі 520 нм.

Матеріали і реактиви. Еталон сечовини (розчин 16,65 ммоль/л), реакційна суміш (диацетилмоноксим-5,0 ммоль/л, тіосемікарбазид-0,9 ммоль/л, сіль заліза тривалентного-25,0 мкмоль /л), розчин сірчаної кислоти-1,8 моль/л, 5 %-ний розчин трихлороцтової кислоти, дистильована вода; мірні колби, пробірки, піпетки, мікропіпетки, центрифужні пробірки, водяна лазня, ФЕК, кювети з товщиною прошарку 1см , центрифуги.

Хід роботи. При визначенні сечовини в сироватках пробу необхідно депротеїнувати 5 %-ним розчином трихлороцтової кислоти. У пробірці змішують 0,10 мл проби з 1,0 мл розчину трихлороцтової кислоти і центрифугують. Точно так розбавляють і еталонний розчин сечовини. Для власне аналізу відмірюють надосадочну рідину. У тонкостінну пробірку відмірюють 0,01 мл сироватки крові або розведеної сечі, додають 2,0 мл робочого розчину і вміст перемішують. Отвір пробірки закривають алюмінієвою фольгою і пробірку поміщають рівно на 10 хвилин на киплячу водяну баню. Потім вміст пробірки швидко охолоджують під струменем холодної води і вимірюють оптичну щільність. Довжина хвилі 490 - 540 нм. Вимір варто провести за 15 хвилин після охолодження. Паралельно опрацьовують еталон і контрольний розчин. Сечу перед аналізом розводять дистильованою водою у співвідношенні від 1/50 до 1/100.

Відміряти	Проба	Еталон	Контрольний розчин
Сироватка, розведена сеча	0,01	—	—
Стандартний розчин сечовини	—	0,01	—
Дистильована вода	—	—	0,01
Робочий розчин	2,00	2,00	2,00
Перемішують і нагрівають точно 10 хвилин на киплячій водяній бані. Швидко охолоджують під струменем води і за 15 хвилин вимірюють оптичну щільність проби (А1) і еталона (А2) проти контрольного розчину.

Розрахунок роблять за формулою: Сечовина (ммоль/л) = 16,65 •

Нормальна концентрація сечовини 2,5 - 8,3 ммоль/л.

Зробити розрахунок і висновки.

Заняття № 15.

Тема: ОБМІН білків. БІОСИНТЕЗ БІЛКІВ (СЕМІНАР)