1.3 Влияние экзогенных и эндогенных факторов на процесс клонального микроразмноженя Orchidaceae и Saintpaulia

На эффективность микроклонального размножения декоративных видов влияет масса факторов различной природы.

Эндогенные факторы

Физиологические, сортовые и видовые особенности растения донора

При выборе материнского растения необходимо учитывать его физиологические, сортовые и видовые особенности. Исходные растения должны быть здоровы, не поражены грибными, бактериальными и вирусными болезнями. Кроме того, они должны находиться в состоянии интенсивного роста (выход из фазы покоя и переход к активному росту) [15].

При выборе экспланта необходимо учитывать его возраст, строение и происхождение. Для обеспечения максимальной стабильности клонируемого материала, во избежание появления аномальных растений в качестве экспланта желательно использовать молодые, слабодифференцированные ткани. Лучше всего использовать кончики стеблей, пазушные почки, зародыши, молодые листья, черенки, соцветия, чешую луковиц, то есть экспланты, содержащие меристемы [15].

Чем меньше эксплант, тем меньшей регенерационной способностью он обладает, и наоборот. Экспланты большего раз­мера, состоящие из паренхимы, проводящей ткани и камбия, могут неза­висимо от соотношения фитогормонов в питательной среде спонтанно образовывать почки. С другой стороны, в крупном экспланте увеличива­ется возможность появления в его клетках вирусов и других патогенов, что препятствует оздоровлению размноженных в культуре тканей расте­ний. Оптимальная величина экспланта зависит от видовых особенностей растения-донора и свойств органа, служащего источником первичного экспланта [8]. Например, у орхидных, используют среднюю длину эксплантов, при этом растения быстро адаптируются и риск заражения патогенами уменьшается [28].

Длительность культивирования

Длительность культивирования также влияет на эффективность микроразмножения. Физиологическое состояние экспланта меняется в течение пассажей, при длительном культивировании частота укореняемости побегов возрастает. Возможно, что при этом эксплант приобретает признаки ювенильности, что ведет к повышению его морфогенетического потенциала [8].

Стерилизация

Успех введения в культуру часто определяется эффективностью стерилизации. Выбор стерилизующего агента определяется особенностями экспланта. Для нежных тканей концентрация стерилизующего агента должна быть снижена, чтобы сохранить жизнеспособность экспланта. Например, для Башмочка настоящего (Cypripedium calceolus L.), чьи коробочки стерилизовали активным хлором с предварительным погружением в 96%-ный этанол; после трехкратной промывки в асептических условиях коробочки вскрывали и незрелые зародыши переносили на модифицированную питательную среду Мурасиге-Скуга с разным содержанием регуляторов роста [41].

Часто внутреннее заражение исходных эксплантов бывает намного сильнее, чем поверхностное, поэтому экспланты также предварительно обрабатывают фунгицидами и антибиотиками против грибной и бактериальной инфекций. Хорошие результаты дает обработка растений бензоатом натрия [42].

Экзогенные факторы

Питательная среда

В зависимости от вида растений необходимо испытывать как твердые, так и жидкие питательные среды. Например, при размножении некоторых видов сенполий, более успешным при индукции множественного побегообразования было культивирование побегов на питательной среде Мурасиге и Скуга, дополненной 1,0 мг/л БАП и 0,2 мг/л ИУК, а для культивирования семян Cephalanthera damosonium Mill. Druce лучшей средой является среда Кнудсона, дополненная 0,5 мг/л ИУК и 2,0 мг/л кинетина. На эффективность размножения могут также влиять расположение экспланта (горизонтальное или вертикальное), тип пробок (ватные, пластмассовые, стеклянные, металлические и т.д.), а также соотношение объема эксплантов и количества питательной среды для оптимального освещения и газообмена эксплантов [18, 43].

Состав питательной среды необходимо подбирать для каждого вида растений. На клональное микроразмножение, наряду с гормонами, влияют ми­неральные соли, витамины и углеводы. При микроразмножении in vitro часто используют среды Мурасиге и Скуга, Линсмайера и Скуга, Нича, Гамборга, Хеллера, Уайта, Кнудсона и другие. Обычно используют среду Мурасиге-Скуга, которая содержит много неорганического азота, что стимулирует процессы органогенеза и соматического эмбриогенеза. Среда Мурасиге-Скуга также способствовует стабилизации хромосомного набора клеток при высоком содержании ауксина в среде. Вообще вопрос оптимального соотношения NH₄:NO₃ остается открытым, так как литературные данные весьма противоречивы и универсального рецепта для всех видов растений нет. В качестве источника углеродного питания используют различные углеводы типа сахарозы, глюкозы, фруктозы, галактозы. Разные культуры требуют различной концентрации углеводов на разных этапах клонального микроразмножения [44].

На клональное микроразмножение и рост растений также влияет и ки­слотность среды, определяющая доступность для растений питательных веществ. Известно, что сильно кислые или щелочные среды лимитируют поступление некоторых элементов, например, фосфора и железа, делая их относительно нерастворимыми и этим ограничивая рост растений. В то же время при высокой кислотности большое количество этих элемен­тов переходит в растворенное состояние и становится токсичным для экс­плантов [3].

Гормоны

Немаловажный фактор, влияющий на успех клонального микроразмножения – гормональный баланс питательной среды. При высоком соотношении гормонов (цитокинин – ауксин) происходит развитие пазушных меристем или образо­вание адвентивных почек, при низком – индуцируется корнеобразование, а при среднем – наблюдается образование и пролиферация каллуса. Наиболее часто при клональном микроразмножении используют ИУК, реже НУК в качестве ауксиновых компонентов, кинетин и БАП представ­ляют при этом цитокинины. Кроме перечисленных цитокининов исполь­зуются и другие, у которых активность в стимуляции образования побе­гов выше. Например, при введении в культуру in vitro сенполий предпочтительнее использовать кинетин, так как БАП задерживает начало первичной регенерации, а из ауксинов – НУК [42, 45].

Температура и условия освещения

Также к экзогенным факторам выращивания относятся температура и условия освещения. На первых двух этапах освещенность колеблется от 1000 до 3000 Лк, фотопериод 14–16 часов, но эти параметры зависят от культуры. Высокая интенсивность света может вызывать хлорозы и задерживать развитие, но при переносе в почву эти растения чувствуют себя лучше и растут энергичнее [46].

Спектральный состав также играет немаловажную роль. Катаева Н.В. и Аветисов В.А. (1981) указывают на синий свет как основной компонент морфогенеза [47]. В работах Т.Н. Константиновой с соавторами (1987) показано, что синий свет усиливает закладку вегетативных почек у различных растений в условиях in vitro , а красный стимулирует развитие цветочных почек. Однако при добавлении цитокининов и ауксинов в различной концентрации соотношение процессов дифференциации цветочных и вегетативных почек меняется, в некоторых случаях наблюдается даже противоположный эффект. Важное значение играет также сочетание спектрального состава света и гормональных факторов среды. Температура культивирования обычно варьирует в интервале 22–26ºС днем и 18–22ºС ночью. В некоторых случаях понижение температуры ведет к повышению эффективности размножения [48]. Для сенполий например, отмечено положительное влияние ламп, с преобладанием излучения в синей части спектра, на процесс размножения побегов, по сравнению с белыми лампами ЛБ 40 и ламп розового свечения на этапе укоренения [37].

Температурный режим зависит, главным образом от вида растений. Так например, для тропических орхидей оптимальная температура выращивания приближается к 27ºС. При клональном микроразмножении пробирочные растения выращивают в климатических камерах, где поддерживается 16-часовой фотопериод и 70%-ная относительная влажность воздуха [49].

Таким образом, для повышения коэффициента размножения расте­ний необходимо каждому виду с учетом его естественного ареала произ­растания подбирать индивидуальные условия культивирования.