1.2 Микроклональное размножение Orchidaceae и Saintpaulia

Технологии клонального микроразмножения представляют исключительную ценность для поддержания биоразнообразия коллекций и сохранения генофонда цветочно - декоративных растений, особенно в тех случаях, когда вид или сорт представлен ограниченным количеством экземпляров или находится под угрозой исчезновения . Кроме того, эти методы позволяют быстро и в достаточном количестве размножить новые сорта и гибриды цветочно-декоративных растений [20].

Современные сорта орхидей, полученные с использованием видов, происходящих из тропиков и субтропиков, занимают ведущее место в мировой цветочной индустрии. Под растения орхидных, выращиваемые на срез или как горшечная культура, заняты значительные площади как в хозяйствах Азии, так и в Европе [27]. Высокой декоративностью обладают сортовые растения, происходящие из родов Cymbidium Sw., Phalaenopsis Blum., Paphiopedilum Pfitz., Dendrobium Sw., Oncidium Sw., Miltonia Lindl., Odontoglossum Н.B.K., Cattleya Lindl., Laelia Lindl. Кроме того, постоянно ведутся поисковые и селекционные работы, направленные на выявление новых, перспективных для внутреннего озеленения видов и создания на их основе устойчивых во внутреннем озеленении сортов орхидей [28].

В настоящее время интродукция тропических и субтропических растений в ботанических садах умеренной зоны является одним из действенных способов их сохранения. Следующий этап их изучения - это выявление их биологических особенностей, разработка эффективных методов размножения и адаптация полученных растений к условиям in situ. По сути, ботанические сады являются музеями живых растений, собранных со всех континентов. Известен целый ряд примеров, когда вследствие нерациональной деятельности человека представители того или иного вида флоры сохранялись лишь в коллекциях ботанических учреждений. Очевидно, что возможности по сохранению ex situ видов мировой форы ограничены, поэтому необходимо искать новые подходы к решению данной проблемы [29].

Для осуществления этих задач в 1974 году в отделе была создана лаборатория микроклонального размножения, целью которой была разработка методов массового размножения растений в асептической культуре. В работе использовали как семена, полученные по делектусам, так и семена репродукции ботанического сада. Проведенные исследования подтвердили гипотезу о том, что семена орхидных вызревают значительно раньше, чем их плоды. В связи с этим, метод высева семян из незрелых коробочек (green capsule culture), более чем на 1/3 сокращает сроки получения сеянцев [30].

В лаборатории проводятся комплексные исследования, направленные на выяснение действия различных компонентов питательных сред на процессы роста и развития сеянцев разных видов орхидных, изучаются их особенности онтогенеза in vitro. Полученные результаты привели к разработке состава универсальной питательной среды для проращивания семян тропикогенных видов орхидных, которая значительно ускоряет темпы развития сеянцев [30].

Постсеменное развитие зародыша орхидных протекает необычно, с формированием специфической структуры – протокорма. Разные виды орхидных отличаются формой и размером протокорма. У эпифитов протокормы сферические, а у наземных видов они имеют вытянутую форму. Установлено, что развитие сеянцев в асептической культуре может проходить двумя основными путями. В первом случае из зародыша формируется первичный протокорм, а из последнего, в дальнейшем, один сеянец. Во втором случае, на теле первичного протокорма формируются конгломераты вторичных протокормов [31].

Таким образом спорофит орхидных, уже на самых ранних этапах онтогенеза, способен к эффективному вегетативному размножению, что является отличительной особенностью представителей этого семейства. Направляя течение онтогенеза по второму пути можно существенно повысить коэффициент вегетативного размножения орхидных in vitro. На сегодня разработаны приёмы семенного размножения более чем 160 видов тропикогенных орхидных, относящихся к 52 родам [30].

Важной составляющей успеха в деле поддержания таксономического состава коллекции орхидных является разработка приёмов микроклонального размножения. Это становится особенно актуально, когда речь идёт о размножении уникальных сортов или видов, от представителей которых не удаётся получить полноценный семенной материал. Поэтому в лаборатории постоянно проводятся работы по разработке методов клонального микроразмножения, усовершенствованию питательных сред, изучению особенностей адаптации к условиям оранжерей сеянцев и растений-регенерантов [32].

Метод клонального микроразмножения орхидных включает в себя несколько этапов: выбор экспланта, стерилизация растительного материала, получение протокормов и ювенильных растений, высадка полученного растительного материала в субстрат. Эксплантами у орхидей могут служить различные части растений: пазушные почки (Calanthe, Cymbidium, Dendrobium, Aranda, Paphiopedilum, Thunia, Vanda), верхушки листьев (Суmbidium, Dendrobium, Epidendrum, Laeliocattleya, Phalaenopsis), верхушки побегов (Cattleya, Cymbidium, Rhynchostylis), листья сеянцев (Саttleya, Laelia, Phalaenopsis) почки цветоносов (Ascofinetia, Neostyllis, Phalaenopsis, Vanda), кончики корней (Сymbidium, Phalaenopsis) [33].

Большое значение имеет время года, в которое вычленяется эксплант, так как в основе сезонных различий регенерационной способности растений лежат изменения их физиолого-биохимичекого состояния. Исследования показали, что лучший рост протокормов и образование растений происходит весной. На выживаемость экспланта влияет и его размер. В целях массового размножения растений используют экспланты размером 0,5-1 см. Для освобождения от вирусной инфекции вычленяют эксплантаты от 0,1 до 0,5 мм и проводят ранее тестирование как протокормов, так и растений-регенерантов [31].

Основная трудность при микроразмножении орхидей состоит в получении асептического материала. Интактные растения находятся в симбиотических отношениях с различными микроорганизмами, поэтому процент контаминации бывает очень высок. Разработаны методы стерилизации эксплантов различных видов орхидных, обеспечивающие получение стерильного материала. Чаще всего в качестве источника эксплантов используют молодые отрастающие побеги и туберидии. При изучении морфогенетического потенциала сортов Cymbidium были отобраны 17 генотипов, обладающих высоким морфогенным потенциалом, высокой продуктивностью цветения и потому пригодных для использования в промышленном цветоводстве [34].

Рост эксплантов орхидей на питательных средах зависит от положения вычленяемых частей на интактном растении. Экспланты, вычлененные из нижней части побега или туберидия, быстрее формируют растения [35].

Как было отмечено выше, первым этапом микроразмножения орхидных является получение протокормов, которые служат основной структурной единицей при микроразмножении. Экспланты орхидных, в зависимости от этапа микроразмножения, культивируют как на твердых, так и на жидких питательных средах. Формирование протокормов начинается через 1-2 месяца после того как эксплант помещён на питательную среду. Полученные протокормы разделяют и переносят на свежие питательные среды. В дальнейшем размножение протокормов происходит в геометрической прогрессии. Установлено, что закладка меристематических центров, образующих в дальнейшем вторичные протокормы происходит в эпидермальных и субэпидермальных слоях тела протокорма. Если конгломераты протокормов не разделять и не субкультивировать, то со временем они начинают формировать растения [31].

Перенос полученных in vitro ювенильных растений в септические условия весьма болезненный процесс для представителей многих видов. Большинство тропикогенных орхидных хорошо переносят период адаптации при высадке в сфагновый мох с последующей пересадкой в легкие питательные землесмеси. В то же время некоторые виды, представители которых являются ярко выраженными эпифитами, необходимо сразу высаживать на блоки [36].

Таким образом, высокий экономический эффект семенного и клонального микроразмножения заключается не только в получении массового посадочного материала в течение кратчайших сроков вне зависимости от времени года, но и в оздоровлении растений от патогенов. Растения, полученные при размножении in vitro, сохраняют все отличительные особенности характерные виду, морфологически выровнены и имеют высокий коэффициент размножения при культивировании их в условиях оранжерей [32].

Что же касается сенполий, то размножение их in vitro требует очень высокой технологии производства. Зарубежные фирмы хорошо освоили этот метод. В России успешное микроклональное размножение сенполии было проведено в лабораторных условиях (1991). И только с 1997 года в научно-производственном центре "Фитогенетика" г.Тула, освоено промышленное производство сенполии. Сейчас она одна из самых популярных комнатных растений. В настоящее время коллекция центра насчитывает не менее 100 сортов [37].

Клональное микроразмножение сенполии основано на их способности размножаться листовыми черенками. Причём в условиях in vitro возможна посадка на питательную среду не только целого листа (без черешка), но и отдельных его фрагментов, хотя чем больше фрагмент листа, тем быстрее идёт образование каллусной ткани. Именно она даёт начало новым растениям: под действием гормонов на каллусной ткани образуются ростовые почки. Затем почки отделяют и пересаживают на свежую среду, где образуются целые пучки молодых растений. Хорошо развитые растеньица укореняют на другой питательной среде [38].

Основные этапы микроклонального размножения сенполий in vitro:

Этап 1: Инициация

Инициация культуры сенполии in vitro: стерильные экспланты (кусочки листа, цветоноса, обработанные стерелизующим раствором) помещают на искусственную питательную среду для размножения.

Этап 2: Формирование и рост микропобегов сенполии

Этап 3: Укоренение

На этом этапе отдельные растения пересаживают на новую питательную среду для укоренения.

Этап 4: Высадка в почву, адаптация.

Микророзетки высаживают в грунт или торфо-перегнойные таблетки и помещают в парник, где поддерживают высокую влажность воздуха в течение 2-3 недель. По мере адаптации растений к естественным условиям,  с началом активного роста, влажность воздуха постепенно снижают [39].

Весь процесс от начала введения в культуру до получения укоренённого растения занимает 7-8 месяцев. Зато потом, в условиях in vitro растения множатся как грибы да и характер роста похожий. Такой высокий коэффициент размножения не даёт ни один другой способ. Однако размноженные таким способом фиалки имеют некоторые особенности. Во-первых, они быстро развиваются и образуют V-образную мощную розетку листьев. Во вторых, клональное микроразмножение приводит к их омолаживанию, поэтому клонированные сенполии способны дольше и больше цвести [40].