MaltsevSciD

Далее мы изучали светорассеяние на лимфоцитах, эритроцитах. Для сравнения одновременно записывались индикатрисы латексных частиц и частиц молочного жира. Структура и профиль индикатрис достаточно сильно различались для измеренных частиц. Так как полистирольные частицы, частицы молочного жира и лимфоциты можно моделировать сферической гомогенной частицей, то было проведено сравнение измеренных индикатрис с индикатрисами, рассчитанными по теории Ми. Индикатрисы показаны на Рис. 4.7 a,c,d. Напомним, что длина волны лазера = 632.8 нм, а показатель преломления воды = 1.333. Литературные данные обнаруживают хорошее согласие для измеренных размеров лимфоцита [40] и частицы молочного жира []. Размер полистирольной частицы совпадает с данными производителя. Данные по показателю преломления полистирольной частицы и лимфоцита также в согласии с литературными данными [118, 40]. Первую попытку измерить индикатрису лимфоцита предприняли Doombos с соавторами [40]. Они использовали оптическую ловушку, чтобы удержать лимфоцит в фиксированном положении. Вращающийся фотоприемние позволял записать индикатрису одиночной частицы в течении 1 мин. Измеренная таким образом индикатриса значительно отличалась от результатов, предсказываемых для лимфоцитов теорией Ми. Данное различие объяснялось нестабильностью положения лимфоцита в оптической ловушке в следствии молости различия показателя преломления среды и частицы.

151

Индикатрисы, представленные на Рис. 4.7, демонстрируют возможности СПЦ в идентификации частиц по светорассеянию. Что касается несферических частиц, то сложность картины светорассеяния не позволяет оценить возможности их идентификации. Следует привлекать дополнительные измерения, чтобы выявлять параметры формы и ориентации таких частиц. Для идентификации частиц по индикатрисам могут использоваться все доступные современные математические методы, такие как – спектральный анализ, анализ изображений, нейронная сеть, параметрический анализ и т.п.

Вслучае сферических частиц идентификация может быть проведена по размеру и показателю преломления с использованием FLSI метода (Раздел 3.3.5.1) или с помощью МНК, подгоняя измеренные индикатрисы к индикатрисам, рассчитанным по теории Ми. В этом случае идентификация частиц не зависит от настройки цитометра и результату могут использоваться в любой день анализа. Естественно что используя достаточно большую скорость анализа частиц, пользователь имеет возможность строить различные статистические характеристики ансамбля частиц, например, распределение по размерам, суммарный объем и т.п.

Внастоящее время латексные частицы играют важную роль в различных технологиях особенно в области биологии и медицины [71, 72, 73]. Поэтому представляется важной возможность СПЦ сертифицировать латексные частицы

сбольшой скоростью, меньшей трудоемкостью по сравнению с электронной микроскопией и высокой точностью определения параметров частиц.

Далее мы продемонстрируем возможности идентификации латексных частиц различных размеров на сканирующем проточном цитометре. Было измерено 6 проб полистирольных частиц. Все параметры цитометра (скорость потока, положение триггерного луча, усиления электронных трактов) не изменялись между измерениями. С помощью FLSI метода были определены основные параметры каждой пробы. Проба N1: средний размер (dср) 1.50 мкм со

стандартным отклонением (σ ) 0.07 мкм, средний показатель преломления (nср)

1.546; Проба N2: dср = 1.50 мкм с σ = 0.08 мкм, nср = 1.686; Проба N3): dср = 2.58 мкм с σ = 0.13 мкм, nср = 1.573; Проба N4: dср = 2.64 мкм с σ = 0.12 мкм, nср = 1.600; Проба N5: dср = 2.97 мкм с σ = 0.11 мкм, nср = 1.597; Проба N6: dср = 4.12

мкм с σ = 0.48 мкм, nср = 1.577. Проба N2 содержала полистирольные частицы

153

покрытые флуоресцентным красителем, что привело к увеличенному значению показателя преломления для этой пробы. Сведенные вместе результаты анализа представлены на Рис. 4.8 в виде карты размеров и показателей преломления. Представленные результаты позволяют заключить, что все проб, за исключением проб N3 и N4, можно идентифицировать по размеру и показателю преломления их частиц. Следует отдельно отметить, что пробы N1 и N2 хорошо разделились по показателю преломления.

Главным преимуществом идентификации частиц по их параметрам является независимость от настроек цитометра. Однако при этом точность идентификации уменьшается из-за систематической ошибки FLSI метода в определении размера и показателя преломления частиц. Для того, чтобы определить истинные возможности сканирующего проточного цитометра в идентификации частиц были проанализированы исходные сигналы светорассеяния для этих проб. Один из таких сигналов представлен на Рис. 4.9. Для идентификации частиц по исходным сигналам использовались временные интервалы в сигналах, показанные на Рис. 4.9. Точка Ptrig соответствует положению триггерного импульса и точка P15 - реперная точка, соответствующая приблизительно углу рассеяния 150. Интервал T0 - время между точками P15 и Ptrig, зависящее от скорости потока и положения триггерного луча. Интервалы T1 и T2 используются в качестве параметров при идентификации частиц, где T1 – время от реперной точки до первого минимума индикатрисы, T2 – время между первым и вторым минимумами (Рис. 4.9). Результат идентификации по исходным сигналам тех же шести проб показан на Рис. 4.10, где в качестве осей использованы интервалы T1 и T2.

154

Рис. 4.8. Карта показателя преломления и размера для шести проб полистирольных частиц. Указаны средние величины размера и показателя преломления для каждой из проб.

155

156

Рис. 4.10. Шесть проб полистирольных частиц идентифицированных по исходному сигналу СПЦ. Числа соответствуют среднему размеру и показателю преломления каждой пробы.

157

Рис. 4.11. Симуляция пространственного расположения анализируемых частиц на карте временных интервалов T1 и T2. Числа на карте соответствуют размеру и показателю преломления частицы.

158

Идентификация частиц по исходным сигналам продемонстрировала большую чувствительность к размеру частиц по сравнению с FLSI методом. Например, пробы N3 и N4 хорошо разделились по исходным сигналам цитометра. Для того чтобы прояснить необычное расположение проб на карте параметров T1 и T2, были рассчитаны индикатрисы по теории Ми для частиц с показателем преломления 1.58 и размерам, изменяющимся от 1.5 мкм до 6 мкм с шагом 0.1 мкм. Рассчитанные индикатрисы были преобразованы в исходные сигналы и интервалы T1 и T2 были определены для каждой индикатрисы. Результат расчетов представлен на Рис. 4.11 и качественно соответствует экспериментальным результатам (Рис. 4.10). Разрывы на карте вызваны переходом минимума через реперную точку.

В случае идентификации частиц по исходным сигналам параметры T0, T1, и T2 зависят от скорости потока и от положения триггерного луча. Естественно, что от дня ко дню скорость потока и положение триггера может меняться, поэтому идентификацию частиц лучше всего проводить одновременно по исходным сигналам и по параметрам частицы. В этом случае, можно реализовать преимущества обоих подходов.

4.4. Анализ содержания жира в молоке на сканирующем проточном цитометре

Сканирующий проточный цитометр можно эффективно использовать при определении содержания жира в молоке. Эта задача решается в настоящее время с использованием анализаторов, требующих проведения калибровки прибора и гомогенизации пробы молока перед измерением. Применение сканирующего проточного цитометра и параметрического решения обратной задачи светорассеяния позволяет исключить данные процедуры при определении содержания жира в молоке.

Сканирующий проточный цитометр был использован при анализе содержания жира в натуральном молоке. Типично размеры жировых частиц распределены от 1 мкм до 10 мкм с максимумом распределения около 2 мкм. Размер белковых мицелл варьируется от 0.01 мкм до 0.2 мкм, что в 5 раз ниже чувствительности срабатывания триггерного канала цитометра. Бактерии также

159

не оказывают влияния на измерения жира, так как их концентрация на три порядка ниже, чем жировых частиц.

Проба свежего молока была разбавлена в 1.11× 104 раз водой, чтобы обеспечить рабочую концентрацию жировых шариков для измерения на сканирующем проточном цитометре. Расход во внутреннем канале составлял величину 1.003× 10-4 мл/сек. Было измерено по 1000 частиц в каждой из 7 проб. В процессе измерения определялся как размер, так и общий объем жировых частиц с помощью FLSI метода. Типичная функция распределения частиц по размерам для жировых частиц представлена на Рис. 4.12. Результаты анализа приведены в Табл. 4.1. Среднее содержание жира в пробе равнялось 3.93% со стандартным отклонением 0.34% (абсолютная величина) при измерении 1000 частиц в каждом измерении. Точность определения среднего значения жирности составила величину 0.13% (абсолютная величина). Очевидно точность измерения жирности может быть улучшена с увеличение количества анализируемых частиц в одном измерении. Важным достоинством использования сканирующего проточного цитометра для измерения жирности молока является отсутствие калибровки цитометра химическим методом. Жирность молока определяется в реальном времени и с простой подготовкой пробы (разбавление). Следует отметить, что все современные инструментальные методы, используемые при анализе молока, требуют проведения трудоемкой калибровки приборов и гомогенизации пробы перед анализом.

Табл. 4.1. Результаты семи измерений пробы молока на сканирующем проточном цитометре.

160