MaltsevSciD

Типичное значение диаметра перетяжки в сканирующем проточном цитометре равно 25 – 35 мкм. Таким образом при данной системе фокусировки лазерного излучения на цитометре можно уверенно измерять индикатрисы частиц с размером вплоть до 10 мкм.

3.3.6.Индикатриса несферической одиночной частицы

Как уже отмечалось в разделе 3.3.1.2 индикатрису частицы произвольной формы можно рассчитать с использованием метода Т матриц. В качестве примера рассмотрим рассеяние на вытянутом сфероиде. В расчетах использовались длина волны падающего излучения - 488 нм и показатель преломления среды - 1.333. Используя матричное представление, рассеяние света несферической частицей может быть записано в следующей форме:

где вектор Стокса в правой части выражения описывает излучение, линейно поляризованное под углом ϕ относительно лабораторной системы координат. Ii – интенсивность падающего излучения, Sij = Sij(θ ,ϕ ) – элементы матрицы рассеяния, (1 0 0 0) – 4-х вектор, описывающий фотодетектор. Выполняя перемножение матриц и интегрируя по азимутальному углу, мы получаем следующее:

131

Рис. 3.30. Трехмерное представление индикатрисы вытянутого сфероида в сферических координатах (log(Is), θ , ϕ ), где Is – интенсивность рассеяния, θ и ϕ - полярный и азимутальные углы рассеяния. Индикатриса рассчитана методом Т матриц при следующих параметрах: диаметр - 0.7 мкм; длина- 2.1 мкм; относительный показатель преломления - 1.048; угол между направлением падающего излучения и осью вращения сфероида - 100.

132

Был рассчитан элемент S11 для вытянутого сфероида с следующими параметрами: диаметр d = 0.7 мкм; длина оси вращения l = 2.1 мкм; относительный показатель преломления - 1.048; угол между направлением падающего излучения и осью вращения сфероида - 100. Элемент S11, рассчитанный в полярных углах рассеяния 100 - 600, показан на Рис. 3.30 в сферических координатах (log(Is), θ , ϕ ). Падающее излучение проходит через центр нижней грани и центр верхней грани координатного куба. Трехмерное представление индикатрисы позволяет сделать заключение, что отклонение направления оси вращения от направления падающего излучения ведет к уменьшению контраста индикатрисы при интегрировании по азимутальному углу.

Рассмотрим более простой случай – когда ось вращения сфероида совпадает с направлением падающего излучения. И в случае сферически симметричной частицы выполняются следующие соотношения:

что, в свою очередь, приводит к следующему:

Следовательно, измеренный сигнал на сканирующем проточном цитометре для частицы с осью вращения, совпадающей с направлением падающего излучения, соответствует элементу S11 матрицы рассеяния. В качестве примера на Рис. 3.31 представлен элемент S11 для сфероида с различными длинами осей вращения.

3.4. Несферическая частица в пуазейлевском потоке сканирующего проточного цитометра

Капилляр оптической кюветы сканирующего проточного цитометра формирует в зоне регистрации радиальный профиль скорости потока, так называемое пуазейлевское распределение. Стационарное движение несферической частицы в пуазейлевском потоке может быть описана в рамках приближения Стокса. Применимость стоксовского приближения зависит от

134

величины числа Рейнольдса Rn = dν /η , где d – размер частицы, ν - разница в скорости на краях частицы и η - вязкость воды. Малое значение числа Рейнольдса для 10 мкм частицы в капилляре сканирующего проточного цитометра позволяет нам использовать приближение Стокса [107]. Используя данное приближение, мы можем записать момент сил, действующий на сфероид: T = µ 2sy0(1+(ε2-1)cos(β)), где µ - коэффициент, зависящий от параметров сфероида, s – параметр профиля пуазейлевского потока, y0 – расстояние от центра сфероида до центра потока, ε - отношение осей сфероида и β - угол между направлением оси вращения сфероида и осью потока. Данный момент сил вращает сфероид внутри пуазейлевского потока. Поток сопротивляется

dβ

вращению с моментом M = µ (ε2+1) dt .

Малая величина числа Рейнольдса в данном случае разрешает нам пренебречь инерционными членами и упростить уравнение вращения сфероида в пуазейлевском потоке до следующей формы:

В решении использовались граничные условия, при которых направление оси симметрии и линии потока совпадают в момент времени t = 0, т.е. β = 0.

Зависимость β(t) представлена на Рис. 3.32, рассчитанная для реальных параметров оптической кюветы и гидродинамической фокусирующей системы сканирующего проточного цитометра. Например, поток поворачивает сфероид на угол 200 за время 0.4 мсек, когда частица находится на краю внутреннего потока (y0 = 5 мкм). Когда частицы находится где-то внутри внутренней струи, угол поворота оказывается меньше, что следует из уравнения (3.47) и данных Рис. 3.32.

135

Проведенный анализ показал важную роль, которую играет момент сил в пуазейлевком потоке, вращая несферическую частицу внутри зоны регистрации сканирующего проточного цитометра. Известно, что на выходе гидрофокусирующей системы частицы ориентированы по потоку [108], эта ориентация расплывается из-за момента сил вращения, когда частицы попадают в зону регистрации. Движение сфероидальных частиц внутри зоны регистрации нестационарное и предварительная ориентация частиц на выходе из гидрофокусирующей системы должна играть большую роль, чтобы можно было эффективно использовать сканирующий проточный цитометр для исследования светорассеяния на несферических частицах.

136

137

3.5. Выводы к Главе 3.

Рассмотренные расчетные методы позволяют оценить ситуацию в быстро развивающейся области - диагностика одиночных частиц с использованием светорассеяния [46, 109]. Представленные данные свидетельствуют о том, что светорассеяние может послужить основой для разработки диагностических методов анализа движущихся частиц. Согласно обзору по проточной цитометрии [4], дальнейшее развитие флуоресцентных методов может быть связано с усложнением методов регистрации (совмещение проточного цитометра с фурье-спектрометром, применение фазочувствительных методов с определением времени флуоресценции и т.д.). К сожалению, перспективы проточной цитометрии с использованием светорассеяния не обсуждаются. По нашему мнению, обработка данных светорассеяния, полученных на сканирующем проточном цитометре, методом FLSI и регистрация флуоресценции во времяразрешенном режиме позволяют модернизировать проточную цитометрию без значительного усложнения регистрирующей аппаратуры. В настоящее время целесообразно приступить к разработке на основе метода FLSI и релаксационной флуорометрии практически удобных методик для использования в пищевой промышленности, медицине и биологии.

Проведен анализ влияния углов сбора излучения, рассеянного одиночной частицей, на точность вычисления размера и показателя преломления методом двумерного рассеяния Ми. Определены оптимальные с точки зрения решения обратной задачи светорассеяния углы сбора.

Предложен и проанализирован метод тройного двумерного рассеяния Ми, позволяющий определять параметры одиночной частицы в диапазонах 3 - 110 по параметру рассеяния α и до 1.12 по относительному показателю преломления. Численно продемонстрированы возможности метода при определении средних характеристик дисперсных сред на примере частиц жира в молоке.

Предложен и проанализирован метод пролетной индикатрисы светорассеяния одиночной частицы, позволяющий вычислять абсолютные

138

значения размера и показателя преломления частицы по полученным эмпирическим уравнениям.

1. Определен диапазон размеров и показателей преломления частиц, для которых существует однозначное решение обратной задачи светорассеяния для метода двухуглового рассеяния; определены оптимальные углы сбора рассеянного излучения;

2.Выявлены особенности формирования индикатрисы одиночной сферической частицы; определен угловой предел применимости дифракционного описания поля рассеяния; предложены 4 новых параметра индикатрисы; получены аппроксимационные уравнения параметрического решения обратной задачи светорассеяния для одиночных гомогенных сферических частиц и частиц с поглощением;

3.Выявлены особенности формирования контраста индикатрисы частицы произвольной формы; предложена функция распределения плотности набега фазы частицы; установлена связь между шириной функции и контрастом индикатрисы;

139

4. ГЛАВА 4. СКАНИРУЮЩАЯ ПРОТОЧНАЯ ЦИТОМЕТРИЯ. ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ

4.1. Сертификация латексных частиц

Для того чтобы сертифицировать среды, содержащие микрочастицы, важно использовать метод, который обеспечивает определение параметров частиц в реальном времени. С другой стороны метод должен быть независимым от использования других, калибровочных методов. Это обеспечит высокие потребительские свойства и широкое распространение. Сканирующая проточная цитометрия удовлетворяет этим требованиям. Важным достоинством сканирующей проточной цитометрии является то, что инструментально эта технология незначительно отличается от классической проточной цитометрии. Основные части сканирующего проточного цитометра те же: лазер, гидрофокусирующая система, фотодетектор, компьютер, линзы, зеркала. Однако, вместо рассеяния вперед и под 900, что присуще стандартной конфигурации в проточной цитометрии, сканирующий проточный цитометр позволяют измерять непрерывную угловую зависимость рассеяния света, индикатрису, одиночной частицы. Кроме того, сканирующий проточный цитометр использует только один фотодетектор по сравнению с приборами, измеряющими многоугловое светорассеяние. Именно индикатриса позволяет практически полностью характеризовать частицу по светорассеянию. В настоящее время сканирующий проточный цитометр позволяет измерять индикатрисы одиночных частиц в широком диапазоне размеров, однако наиболее эффективно исследуются частицы с размерами от 0.5 мкм до 15 мкм.

140