3. Выбор и обоснование способа производства

В производстве ферментных препаратов из животного сырья наиболее приемлемым, как с технологической, так и с экономической точек зрения, является применение экстракции с последующей очисткой полученного экстракта.

Проведение процесса экстракции, которая является основной стадией получения фермента обеспечивает высокий выход (более 90 %), малые затраты экстрагента, позволяет сократить производственный цикл и не требует сложного аппаратурного оформления.

Высокий выход на стадии экстракции обеспечивается правильным подбором экстрагента, что позволяет максимально извлечь фермент из сырья с минимальными временными затратами, и позволяет минимизировать его расход. При выборе экстрагента необходимо, чтобы он удовлетворял ряду требований:

- экстрагируемое вещество должно быстро и максимально полно извлекаться из сырья;

- экстрагент не должен приводить к инактивации фермента, то есть должен обеспечивать проведение экстракции в мягких условиях;

- расход экстрагента должен быть минимальным;

- экстрагент должен растворяться в воде в любых соотношениях;

- экстрагент, по возможности, должен быть не токсичен для работающего с ним персонала;

- при дальнейшей обработке фермент должен максимально полно, без больших затрат, очищаться от экстрагента, то есть экстрагент не должен вступать с ферментом в химические реакции;

- экстрагент должен быть доступным с экономической точки зрения и др.

Для эффективной экстракции необходима предварительная подготовка сырья, такая как измельчение с целью увеличения общей поверхности контакта с экстрагентом, для увеличения выхода на стадии экстракции.

В данном случае, при производстве цитохрома С, с помощью опытов было определено, что наиболее подходящим экстрагентом является 2,5 % раствор трихлоруксусной кислоты. Экстракция проводится в мягких условиях, данная кислота является селективной и экономически доступной.

Механизм экстракции проходит через 3 стадии:

1) Проникновение экстрагента в пористую структуру;

2) Растворение цитохрома С в экстрагенте;

3) Диффузия растворенного цитохрома С в раствор трихлоруксусной кислоты.

Сразу после соприкосновения трихлоруксусной кислоты и цитохрома С они начинают смешиваться: молекулы цитохрома С в процессе его беспорядочного теплового движения будут переходить в трихлоруксусную кислоту и, наоборот, молекулы трихлоруксусной кислоты будут переходить в среду экстрагируемого вещества (в сердца КРС) и растворять его. Чем больше разность концентраций экстрагируемого вещества в сырье и растворителе, тем интенсивнее происходит диффузия. Кроме того, чем больше поверхность соприкосновения экстрагируемого вещества с растворителем и длительность соприкосновения, тем большее количество вещества будет диффундировать в единицу времени в данной системе.

После экстракции проводится отжим фарша на фильтрующей центрифуге, жмых направляется на мясоперерабатывающий комбинат, где используется для приготовления бульонных кормовых добавок для скота, что позволяет уменьшить количество отходов производства, а экстракт передается на высаливание.

После экстракции проводится химическая очистка путем высаливания балластных белков с их дальнейшим отделением на сепараторах. Процесс высаливания основан на дегидратации неполярных участков молекул цитохрома С при добавлении аммония сульфата, что приводит к агрегации цитохрома С, резкому падению его растворимости и выпадению в осадок, за счет взаимодействия неполярных участков молекул. Выпадение балластных белков зависит от размера их молекулы. После процесса первого высаливания агрегируются крупные молекулы, а более мелкие осаждаются после второго. Это позволяет в кратчайшие сроки (около двух часов) и с высокой степенью эффективности очистить экстракт от примесей. Использование в качестве высаливающего вещества аммония сульфата позволяет существенно снизить экономические затраты на этом этапе получения цитохрома С, благодаря дешевизне аммония сульфата.

После процесса высаливания проводят дальнейшую очистку путем осаждения цитохрома С из осветленного экстракта путем добавления 20 % раствора трихлоруксусной кислоты, что крайне удобно так как требуются незначительные количества ТХУ и раствор можно готовить на несколько загрузок в аппарате небольшого объема. Процесс осаждения идет за счет снижения растворимости цитохрома С до уровня, при котором начинаются агрегация и осаждение.

Выпавший осадок цитохрома С, очищается при помощи растворения в насыщенном растворе аммония сульфата. Это в короткий срок (около десяти минут) позволяет получить осадок цитохрома С высокой степени чистоты.

Дальнейшая обработка сводится к отделению надосадочной жидкости на центрифуге и получению обессоленного раствора на ультрафильтрационной установке на полых волокнах из ацетата целлюлозы с d_пор ≤ 3 нм. Ультрафильтрация – процесс разделения высокомолекулярных соединений в жидкой фазе с использованием селективных мембран, пропускающих преимущественно или только молекулы низкомолекулярных соединений. Для ускорения процесса ультрафильтрации ее проводят при перепаде давления по обе стороны мембраны: повышенным давлением. При проведении диафильтрации в раствор цитохрома С вводят растворитель – обессоленная вода, в количестве, равным количеству отбираемого фильтрата. Ионы, которые плохо задерживаются мембраной, переходят вместе с водой в фильтрат. С помощью диафильтрации достигается высокая степень очистки. При разбавлении водой осадок цитохрома С будет содержать меньше примесей. При ультрафильтрации применяют полупроницаемые мембраны, которые отвечают следующим основным требованиям:

- высокая разделяющая способность (селективность);

- высокая удельная производительность (проницаемость);

- устойчивость к действию среды разделяемой системы и ее компонентам;

- неизменность характеристик в процессе эксплуатации;

- достаточная механическая прочность;

- низкая стоимость.

Ультрафильтрация позволяет резко сократить продолжительность стадии и повысить выход, по сравнению с диализом, который используют на заводе (с 5 – 6 суток до нескольких минут и выход с 36 до 48 % за счет снижения инактивации цитохрома С). Также особенностью ультрафильтрации является возможность осуществления процесса даже при комнатной температуре.

Далее проводится стандартизация раствора цитохрома С при добавлении 0,9 % хлорида натрия для доведения концентрации цитохрома С до значения 2,5 – 2,9 мг/мл и 10% раствора гидроксида натрия для поддержания рН 6,5 – 7,0. Стандартизированный раствор передается на стадии получения стерильного продукта.

Таким образом, предложенная технология является сравнительно малозатратной благодаря небольшому количеству используемых веществ и их дешевизне, обеспечивающей более высокий общий выход производства и значительное сокращение производственного цикла, то есть повышает оборачиваемость капитала и позволяет снизить негативное влияние на окружающую среду, благодаря использованию нетоксичных и малотоксичных веществ.