Основы жидкостной хроматографии.

Хроматография как метод разделения веществ была предложена М. С. Цветом в 1903 на примере жидкостной хроматографии.

Жидкостная хроматография (ЖХ) – это метод разделения и анализа сложных смесей веществ, в которых неподвижной фазой служит жидкость. Метод ЖХ применим для разделения широкого круга веществ, поскольку большинство веществ не обладает летучестью, многие из них неустойчивы при высоких температурах (особенно высокомолекулярные соединения) и разлагаются при переведении в газообразное состояние. В ЖХ разделение чаще всего происходит при комнатной температуре. Особенности всех видов ЖХ обусловлены наличием жидкой неподвижной фазы.

Процесс анализа пробы делится на 2 этапа:

1. разделение пробы на составляющие компоненты;

2. детектирование и измерение содержания каждого компонента.

Задача разделения решается при помощи хроматографической колонки, которая представляет собой трубку, заполненную сорбентом. При проведении анализа через хроматографическую колонку подают жидкость (элюент) определенного состава с постоянной скоростью. В этот поток вводят точно отмеренную дозу пробы.

Компоненты пробы, введенные в хроматографическую колонку, из-за их разного сродства к сорбенту колонки двигаются по ней с различными скоростями и достигают детектора последовательно в разные моменты времени.

Таким образом, хроматографическая колонка отвечает за селективность и эффективность разделения компонентов. Подбирая различные типы колонок можно управлять степенью разделения анализируемых веществ. Идентификация соединений осуществляется по их времени удерживания. Количественное определение каждого из компонентов рассчитывают, исходя из величины аналитического сигнала, измеренного с помощью детектора, подключенного к выходу хроматографической колонки.

Применяя различные элюенты, можно изменить параметры удерживания и селективность хромотографической системы. Селективность в ЖХ определяется двумя факторами – природой подвижной (элюент) и неподвижной фаз.

Различают колоночную жидкостную хроматографию, в которой через колонку, заполненную неподвижной фазой, пропускают порцию разделяемой смеси веществ в потоке элюента (под давлением или под действием силы тяжести), и тонкослойную жидкостную хроматографию, в которой элюент перемещается под действием капиллярных сил по плоскому слою сорбента, нанесенного на стеклянную пластинку или металлическую фольгу. Разработан также метод тонкослойной жидкостной хроматографии под давлением (элюент прокачивают через слой сорбента, зажатого между пластинами).

К жидкостной хроматографии обычно относят также гидродинамическую хроматографию, где неподвижная фаза отсутствует. В этом случае используют тот факт, что скорость потока элюента максимальна в центре полого капилляра и минимальна у его стенок, а разделяемые компоненты распределяются между движущимися с разной скоростью слоями элюента в соответствии со своими размерами или под влиянием наложенного в поперечном направлении внешнего силового поля (центробежного, электрического, магнитного).

По механизму удерживания разделяемых веществ неподвижной фазой жидкостная хроматография делится на осадочную хроматографию, адсорбционную, распределительную, ионообменную хроматографию (в т. ч. ионную хроматографию).

Осадочная жидкостная хроматография основана на различной растворимости осадков, образующихся при взаимодействии компонентов анализируемой смеси с реагентом-осадителем. Преимущества метода в том, что получающиеся вдоль сорбента зоны имеют резкие границы, содержат осадки только одного вещества и часто разделены зонами чистого сорбента. Метод пока не нашел широкого распространения.

Адсорбционная жидкостная хроматография в зависимости от относительной полярности сорбента и элюента подразделяется на нормально-фазную и обращенно-фазную. В первом случае адсорбция веществ происходит на полярном сорбенте [напр., силикагеле, содержащем гидроксильные (силанольные) группы] из неполярного элюента благодаря донорно-акцепторному взаимодействию или образованию водородных связей. Во втором - на поверхности сорбента из полярного элюента благодаря дисперсионному (гидрофобному) взаимодействию разделяемых молекул с поверхностью (образование водородной связи возможно в подвижной фазе с молекулами элюента, который, как правило, содержит воду).

В распределительной жидкостной хроматографии разделение основано на распределении веществ между двумя жидкими фазами: неподвижной, нанесенной на поверхность носителя, и подвижной элюентом. В зависимости от полярности жидких фаз возможны нормально-фазный и обращeнно-фазный варианты. В первом случае на поверхность или в поры пористого носителя наносится полярная жидкость, не смешивающаяся с неполярным элюентом, во втором - используется неполярная неподвижная фаза и полярный элюент.

К распределительной жидкостной хроматографии относится и экстракционная жидкостная хроматография, в которой неподвижной фазой служит органический экстрагент, нанесенный на твердый носитель, а подвижной - водный раствор разделяемых соединений. В качестве экстрагентов используют диалкилфосфорные и алкилсульфоновые кислоты, фенолы (кислотные экстрагенты), триалкилфосфаты, фосфиноксиды и др. (нейтральные экстрагенты), амины, четвертичные аммониевые основания, а также серосодержащие фосфорорганические соединения и др. Применяется для разделения и концентрирования неорганических соединений, напр., ионов щелочных металлов, актиноидов и других близких по свойствам элементов, в процессах переработки отработанного ядерного горючего.

В ионообменной жидкостной хроматографии разделение основано на различной способности разделяемых ионов к реакции ионного обмена с фиксированными ионами сорбента, образующимися в результате диссоциации ионогенных групп последнего. В зависимости от знака заряда фиксированных ионов различают катиониты (закреплен анион) и аниониты (закреплен катион). Разделение ионов регулируют подбором оптимальных значений рH элюента и его ионной силы. Вариант ионообменной жидкостной хроматографии - ионная хроматография, в которой разделенные анионы (катионы) детектируют в виде кислот (соотв. оснований) высокочувствительным кондуктометрическим детектором, а высокоэффективные колонки наполнены поверхностно-активным ионитом с небольшой емкостью.

Жидкостная хроматография важнейший физико-химический метод исследования в химии, биологии, биохимии, медицине, биотехнологии. Ее используют для анализа, разделения, очистки и выделения аминокислот, пептидов, белков, ферментов, вирусов, нуклеотидов, нуклеиновых кислот, углеводов, липидов, гормонов и т. д.; изучения процессов метаболизма в живых организмах лекарственных препаратах; диагностики в медицине; анализа продуктов химического и нефтехимического синтеза, красителей, топлив, смазок, нефти, сточных вод; изучения изотерм сорбции из раствора, кинетики и селективности химических процессов. Жидкостную хроматографию используют также в парфюмерии, пищевой промышленности, для анализа загрязнений окружающей среды, в криминалистике.