ОБОНЯНИЕ

Роль обоняния

Полагают, что носу принадлежит единственная сенсорная роль – обнаруживать запахи. Обоняние – способность ощущать и идентифицировать запахи (Овчинников Ю.М. и др., 1999).

Биологичекая роль обонятельных сигналов.

Особенности обоняния у человека.

(Кн. Овчинникова Ю.М. и др., 1999). Рецепция пахучих веществ – это информирование о присутствии в окружающей среде определенных химических соединений, выполнение сигнальной функции: пищевой, половой, охранительной, ориентировочной.

Обонятельная функция человека объединяет 2 взаимодействующих компонента: восприятие и дифференциация запахов. Условный рефлекс на стимуляцию «приятными» и «неприятными» запахами формируется только на 7 – 8-м месяце жизни ребенка. Диапазон пороговых концентраций различных пахучих веществ в воздухе, воспринимаемых человеком, очень велик – от 10^-14 до 10^-5 моль∙л^-1. Имеется значительный индивидуальный разброс в чувствительности людей к запахам и в их гедонической оценке. Существуют различия между представителями различных культур. Так, в ходе германо-японского межкультурного обследования женщинам из одинаковых возрастных групп предъявляли стандартный набор веществ, представляющих бытовые запахи. Обнаружились существенные расхождения в обонятельном восприятии одних и тех же веществ по таким параметрам запаха, как приятность, узнаваемость, связанность с пищей, а также в оценках интенсивностей запахов.

Показно существенное отрицательное влияние на обоняние курения. Показано: пожилые люди перестают оценивать запах меркаптана как неприятный, что потенциально увеличивает для них риск использования бытовых газовых приборов, так как меркаптан добавляют в природный газ для придания ему неприятного запаха.

Большой процент людей не воспринимает запах андростенона (избирательная аносмия), 3% - запах пота (изовалериановая кислота), 12% - экзальтон, мускусный запах.

Способность воспринимать запахи максимальна в 20 лет, к 70ьгодам она постепенно снижается и стремительно убывает после 80 лет. Однако эти данные могут расходиться у разных авторов.

Центральные обонятельные образования тесно связаны со стволом мозга, что объясняет влияние запахов на эмоциональное состояние человека, его работоспособность. «Приятные» запахи увеличивают температуру кожи, снижают артериальное давление, «неприятные» - противоположное воздействие. Определенное значение имеет обоняние в сексуальном поведении человека: ассоциация запахов цветов, духов и пр. с информацией, находящейся в подсознании, может оказывать явное эротическое влияние.

Важна также вкусовая роль обоняния.

Чувствительность обоняния к одоному и тому же пахучему веществу весьма вариабельна и лабильна. Ее колебания даже у одного человека зависит от многих факторов и находится в широких пределах в отношении 1:50. Влияние на обонятельную чувствительность оказывают факторы окружающей среды (температура, влажность), гормональные фактоы, эмоциональный фон. Восприятие запахов зависит от общего состояния человека, доминирующей мотивации, силы раздражителя, предшествующего опыта.

Обоняние – основная сенсорная модальность, которая обеспечивает животным существам восприятие информации из венешнего мира. Ольфакторная система воспринимает 2 основных класса стимулов: а) одоранты общего характера (обычные), мелкие молекулы, происходящие от пищи, огня или хищников; это летучие химические вещества с Мм около 300 и меньше; или б) феромоны, молекулы, высвобождаемые членами одного и того же вида, которые передают социальные или сексуальные сегналы. Хемосенсорные рецепторы по лигандам, которые их активируют, подразделяют на одорантные рецепторы (OR) и феромональные рецепторы (ФР). Периферические рецепторные клетки, экспрессирующие OR и ФР, посылают сигналы в раздельные центры в мозг, перерабатывающие информацию об одоранте или феромоне, чтобы вызвать различные поведенческие и нейроэндокринные реакции.

Однако роль обоняния у животных и человека обширная. По существу все – от микробов и растений до животных выдяляют запахи в качестве ароматов или в качестве продуктов метаболизма или экскреции отходов. Запахом обладают также неорганические вещества, такие, например, как аммиак или сероводорд, а также некоторые металлы. Чувство запаха помогает идентифицировать пищу, оценивать ее качество и усиливать ее вкус. Активация носовых хемосенсорных клеток предостеригает от потенциальных токсических веществ или патогенов. Ольфакторная система обнаруживает информацию даже о репродуктивном статусе, гендрной и генетической идентичности. Во всех этих случаях активация хемосенсорных клеток в носовой полости инициирует процесс нейронального опознавания, который может влиять на поведение, гормональное состояние и эмоции. Таким образом, все одоранты могут использоваться животными для повышения шансов для выживания, позволяя им определять местонахождение источника пищи и избегать хищника и такие внешние опасности, как пожар.

Основная ольфакторная система (ООС)

ООС состоит из: 1) Основного ольфакторного эпителия, включающего цилиарные обонятельные клетки, микровиллярные клетки неопределенной функции, опорные клетки, которые могут выполнять глия-подобную роль, и популяции клеток-предшественников (стволовых клеток, которые пополняют эту регенерирующую ткань).

2) Основной олтьфакторной луковицы, области переднего мозга, иннервируемой аксонами обонятельных клеток и служащей в качестве первого центра переработки ольфакторной информации.

3) Более высокие обонятельные центры, которые получают прямую или непрямую информацию из ОЛ.

Роль ООС:

ООС явяляется хорошо настроенным сенсором. Он реагирует на тысячи летучих химических вевществ, несущих информацию о качестве пищи и наличии патогенов, жертвы, хищника. Накапливаются данные, что ООС чувствительна также к хемосенсорным стимулам, которые сообщают информацию между животными, которая может вызывать специфические поведенческие и гормональные реакции (Munger et al., 2009 – обзор). Эта функциональная гетерогенность говорит о том, что ООС состоит из нескольких обонятельных путей, которые выполняют специфическую хемосенсорную роль.

В обзоре Elsaesser R., Paysan J. (2005) говориться, что в 1855г. Alexander Ecker (1822 - 1905), профессор анатомии в университете Freiburg им. Breisgau (Германия), первым из анатомов с помощью световой микроскопии исследовал ОЭ человека.

Обзор Zelan c., Sobel n. (2005). Ольфакторный эпителий человека in vivo.

От ОЭ человека in vivo регистрировали ЭОГ с помощью эндоскопического введения тубулярного электрода в носовую полость (). С помощью ЭОГ авторы уточнили расположение ОЭ у человека. Оказалось, что протяженность обонятельной области человека на около 2 см более anterior, чем отмечали прежде ().

В статье Шепелевой В.К. (1971) приводятся данные по развитию органа обоняния у разных видов животных. Так, по ее мнению, орган обоняния достигает высшего развития и совершенства у млекопитающих. Обонятельная поверхность у них увеличивается особыми выступами – этмоидальными раковинами. У хищных насекомоядных и грызунов их 5, у приматов 1 – 3, у человека – 2, у собаки – 6 основных и несколько добавочных раковин. Наибольшее развитие орган обоняния получил у копытных и хищных млекопитающих, а также у насекомоядных. У грызунов этот орган развит в меньшей степени.

Обонятельный эпителий включает 4 типа клеток: обонятельные клетки, опорные, микровиллярные и базальные. Эти же типы клеток упоминаются и в обзоре Elsaesser R., Raysan J. (2005, 2007). По данным их обзора, цилиарные и микровиллярные обонятельные клетки встречаются у всех позвоночных. Вместе с тем, отмечают, что у акул, скатов и рэтфиш имеются только микровиллярные обонятельные клетки, тогда как у миног, лягушек, змей и черепах – только цилиарные, а у костистых рыб и саламандр – оба типа обонятельных клеток рядом друг с другом. У птиц же отдельные обонятельные клетки несут одновременно ОЖ и микровиллы (). Что касается млекопитающих, картина неясна. По данным обзора, у них различают по крайней мере 5 классов обонятельных микровиллярных клеток (кроме цилиарных микровиллярных опорных и базальных) (). Функции этих специфических клеток пока не определены.

Полагают, что некоторые микровиллярные клетки представляют второй класс биполярных обонятельных клеток (). Описывается микровиллярный тип биполярных обонятельных клеток (тип В клеток), морфология которых, с точки зрения авторов, является типичной биполярной клеткой. Согласно данным других авторов (), существует доказательство того, что есть второй морфологически отдельный класс биполярных обонятельных клеток в ОЭ млекопитающих. Однако не доказано нейронального присхождения этих микровиллярных клеток. Показано, что они не дегенерируют после удаления ОЛ, что является доказательством их ненейронального происхождения. Таким образом, участие этих клеток в восприятии запаха мало вероятно.

Существует другая точка зрения на роль микровиллярных клеток. Известно, что обонятельные клетки периодически умирают путем апоптоза, постоянно регенерируя из отдельной популяции зрелых нейрональных стволовых клеток. Чтобы избежать непропорционального роста или дегенерации ткани ОЭ в течение жизни, оба процесса – клеточная смерть и регенерация – должны точно координироваться. Показано (), что среди факторов, которые вносят вклад в этот контроль, являются нейропептиды (). В зрелом ОЭ нейропептид Y высвобождается из неохарактеризованного ряда клеток (). Теперь авторы обзора показывают, что клетки, экспрпессирующие NPY, идентичны микровиллярным обонятельным клеткам (). Эти данные повышают вероятность того, что ольфакторные микровиллярные клетки связывают сигналы на поверхности ольфакторной слизистой с пролифирацией и дифференцировкой обонятельных стволовых клеток на основании эпителия. Представляют ли эти клетки второй класс обонятельных клеток остается, спорным.

Нейрогенез в ОЭ проходит через всю жизнь, однако рождение и дифференцировка обонятельных клеток интенсивно исследовалась в обонятельном эпителии грызунов, но не у человека. В работе Hahn C.-G. et al. (2005) сделана попытка охарактеризовать базальные и дифференцирующиеся клеточные компоненты ОЭ человеак с помощью иммуногистохимических методов и молекулярную экспрессию обонятельного эпителия человека in vivo и in vitro. Однако авторы находят недостатки в работе с культурами обонятельных клеток, выращенных из биопсии обонятельного эпителия, так как обонятельные клетки в культуре, даже если и отвечают на одоранты изменением концентрации кальция, как и in vivo, проявляют незрелую клеточную морфологию и не обладают активностью Na-каналов. Он пишет, что известно, что в обонятельном эпителии грызунов базальные клетки представлены в двух типах: горизонтальные и сферические (шаровидные), которые различаются по морфологии и функции. Считают, что эти клетки являются мультипотентными клетками и/или предшественниками обонятельных клеток, которые могут пролифирировать и дифференцироваться в нейрональные или не нейрональные клетки (см. ссылки в работе). У грызунов, как предшественники обонятельных клеток, в дальнейшем дифференцируют и созревают и мигрируют из базального слоя к апикальному, к назальной ламинальной стороне эпителия. ОЭ грызунов хорошо охарактеризован по различным типам клеток, а экспрессия различных нейрональных молекул связана со специфическими стадиями нейрональной дифференцировки. В настоящем исследовании предложено объяснение этапов клеточной дифференцировки, которое сводится к тому, что это процесс, в котором мультипотентные клетки дифференцируют через ряд стадий, которые могут включить одну или больше пролиферирующих (размножающихся) и незрелых форм. Эти стадии получили название: proliferating neuronal precursor cells – immature neurons – mature neurons (см. Ссылки в работе).

Однако в ОЭ человека, по-видимому, нет морфологического различия между базальными клетками, причем, почти все они имеют круглые клеточные тела, сходные со сферическими базальными клетками грызунов. В отличие от грызунов, базальные клетки человека, включая предполагаемые предшественники обонятельных клеток, экспрессируют p75NGFR (низкоафинный рецептор к фактору роста нервов), означая, что p75NGFR играет в нейрогенезе ОЭ человека роль, отличную от грызунов. Молекулярная экспрессия обонятельных клеток в ходе дифференцирования ОЭ у человека в общем сходна с таковой у грызунов. Однако топографическая организация незрелых и зрелых обонятельных клеток в ОЭ человека отличается от грызунов тем, что незрелые и зрелые обонятельные клетки у человека рассеяны по всему ОЭ, тогда как у грызунов они имеют ламинарную организацию: слой базальных клеток, слой незрелых, слой зрелых обонятельных клеток, слой опорных клеток. Это означает, что когда клетки нейронального происхождения созревают, они мигрируют из базальной к апикальной стороне. Рождение и дифференцирование ОЭ у человека отличается от грызунов. При загрузке пролифирурующих клеток антителами к Ki-67, маркеру клеточного цикла, показано, что около 80% пролифирирующих клеток находится в нижней трети ОЭ человека. Чтобы идентифицировать обонятельные клетки, срезы ОЭ человека исследовали по экспрессии нейрональных молекул GAP-3, бета-тубулин 3, VAP 1B, NCAM и OMP. MAP-1B и NCAM идентифицируют дендриты и аксоны обонятельных клеток и интенсивно маркируют нервные веточки. Некоторые клетки в ОЭ человека были иммунореактивны только по бета-тубулину-3 и не реактивны по ОМР, что, вероятно, связано с тем, что они незрелые обонятельные клетки. В ОЭ человека, хотя базальные клетки, по-видимому образуют слой базальных клеток, как у грызунов, ламинарной организации незрелых и зрелых обонятельных клеток не существует. По-видимому, координация, миграция и топографическая организация нейронального дифференцирования не находится в таком большом согласии в ОЭ человека, как у грызунов, и что обонятельные клетки человека не двигаются ближе к апикальной поверхности, когда они зрелые.

Авторы статьи отмечают, что обонятельные клетки, выращенные в диссоциированных культурах биопсии ткани ОЭ, могут отвечать на стимуляцию одорантами изменением концентрации внутриклеточного кальция. Эти клетки экспрессируют различные молекулы нейрональных клеток, но не все свойства их копировали in vivo (то есть свойства в культуре отличаются от свойств in vivo). Например, культивированные обонятельные клетки в культуре сохраняли биполярную морфологию, как и клетки in vivo, но клетки in vitro обычно имели тела круглой формы и более тонкие отростки, и они не имели терминальной булавы с обонятельными жгутиками. Это означает, что они были недозрелыми.

А.И. Бронштейн (1950) показывает, что ОЭ у человека располагается в области верхних носовых ходов и имеет площадь, равную 5,0 кв.см. Он пишет, что трудами Пашутина (1872), Грима (1873), Сизова (1879) и особенно Догеля (1887) доказано, что обонятельные клетки являются нервными клетками. Теперь их рассматривают как первый нейрон обонятельных путей. На каждые 160 обонятельных клеток приходится ~100 опорных.

В работе Овчинникова Ю.М. и др. (1999) указывается, что по данным новейших морфологических исследований у человека число обонятельных рецепторных клеток достигает около 6 млн. (по 3 млн. на каждой стороне), из них 90% - жгутиковые, а 10% - микровиллярные клетки. У кролика – 100 млн., а у собаки – 200 млн. рецепторных клеток. Жизненный цикл рецепторынх клеток может длиться несколько месяцев, но при повреждении ОЭ процессы регенерации значительно ускоряются. У лабораторных мышей после перерезки ОН обонятельные клетки через 10 дней заменяются новыми. Процесс регенерации ОЭ завершается в течение около месяца. Аксоны новых клеток прорастают в сохранивишиеся оболочки Швановских клеток, окружавшие пучки старых волокон, и устанавливают синаптические связи в гломерулах ОЛ. На этом этапе происходит восстановление обонятельной функции.

В работе Jenkins P.M. et al. (2009) расмматривается структура ОЖ и связь их функции с болезнями человека. Ссылаясь на работу Menco (1984), он утверждает, что ОЖ теряют у млекопитающих динеин, поэтому неподвижны. Вместе с тем авторы говорят о том, что у некоторых немлекопитающих позвоночных, таких как золотая рыбка и лягушки (Reese 1965; Lidow and Menco, 1984), обонятельные жгутики подвижны, так как имеют аксонему, напоминающую в своих проксимальных сегементах аксонему как у респираторных ресничек, и выплняют роль при клиренсе одоранта (Bronshtein and Minor, 1973; Mair et al, 1982).

Далее авторы рассматривают аксонему ОЖ.

Аксонема ОЖ (По работе Jenkins P.M. et al. (2009).

Большинство современных представлений о структуре ОЖ основывается на ранних исследованиях электронной микроскопии (). Эти данные свидетельствуют о том, что ОЖ млекопитающих имеют около 50 – 60 мкм в длину и делятся на 2 различных участка: проксимальный сегмент и дистальный сегмент. Более толстый проксимальный сегмент выдается на 2 – 3 мкм от базального тельца в конфмгурации (9*2) + 2 толщиной около 300 нм (Menco, 1997). Дистальный сегмент выдается на остальные около 50 мкм и уменьшается до конфигурации аксонемы, состоящей из 1 – 4 синглетных MTs (Рис.1С) (Menco, (1997), большинство которых состоит главным образом из пары синглетных MTs. Дистальные сегменты ОЖ ориентированы параллельно поверхности ОЭ. Так как на 1 обонятельной клетке много ОЖ (10 – 30 ОЖ) и так как они выдаются на большие расстояния от булавы, существует большое перекрытие ОЖ от разных обонятельных клеток (). Этот переплетающийся «коврик» ОЖ увеличивает сенсорную поверхность ОЭ ~ в 40 раз, таким образом, увеличивая нашу способность детектировать одоранты (Menco, 1992).

Цилиарная аксонема состоит из длинных пучков α и β тубулиновых димеров, которые образуют структурную основу ОЖ (Rosenbaum and Witman 2002; Scholey, 2003). Эти микротрубочки обеспечивают путь для таких молекулярных мотров, как кинезин и динеин для транспорта грузов в и из ОЖ. Аксонемы ОЖ ориентированы, причем плюс конец микротрубочек локализуется в дистальной вершине ОЖ (Рис. 1С), что означает, что моторы, направленные к плюс-концу, переносят грузы к вершине ОЖ, тогда как моторы, напаравленные к минус-концу, ответственны за возвращение груза (Rosenbaum and Witman 2002; Scholey, 2003).

Недавно исследовали ряд посттрансляционных модификаций тубулина, которые играют функциональную роль в регуляции транспорта грузов ().Обнаружили в цилиарной аксонеме многие модификации тубулина, включая ацетилирование (α), полиглутамилирование (α + β), полиглицилирование (α + β) и детирозинирование (α). Хотя все эти модификации обнаружили в ОЖ, их точное функциональное значение неизвестно (Schwarzenbacher et al., 2005; Pathak et al., 2007). Однако последние исследования показали что у зебра-рыбок, потерявших энзим, ответственный за полиглутамилирование, теряют ОЖ (Pathak, 2007). Это означает, что посттрансляционные модификации тубулина играют определенную роль в сборке и сохранении ОЖ.

Помимо изменений в структуре аксонемы существует доказательство гетерогенности в содержании белков вдоль длины ОЖ. Проксимальные и дистальные сегменты ОЖ могут представлять различные субклеточные компартменты. В ходе развития сигнальные протеины, по-видимому, локализуются по-разноме между этими 2 областями. В заново образованных ОЖ ольфакторные сигнальные белки более ровно распределены меду проксимальным и дистальным сегментами. В зрелом ОЖ такие сигнальные молекулы, как G_olf, ACIII и CNG-каналы, по-видимому, преимущественно локализуются в дистальном сегменте, где осуществляется первый контакт одоранта с обонятельным рецептором (). Это кластрирование сигнальных молекул на сайте, на который дествует одорант, может увеличивать эффективность одорант-стимулируемой сигнализации.

Далее авторы рассматривают липидный состав ОЖ.

Аксонема ОЖ окружена липидной мембраной, которая играет важную роль в обонятельной сигнализации. Канонический путь обонятельной сигнализации включает некоторые периферические и трансмембранные белки; поэтому, вероятно, существует динамическая реципрокность между обонятельными сигнальными белками и мембранными липидами ОЖ, так что пертурбация мембранных липидов может влиять на ольфакторную сигнализацию.

Растет число доказательств роли липидных микродоменов мембран, обогащенных холестеролом и сфинголипидами, в организации ольфакторных сигнальных белков (Schreiber et al., 2000; Kobayakawa et al., 2002; Brady et al., 2004).

Schreiber et al. (2000) показали, что в ОЭ изоформы G-белка и АЦ, вовлекаемые в обонятельную сигнализацию, ассоциируют с липидными массивами (rafts). Они также отметили, что Golf и АЦIII взаимодействуют с холестерол-связывающим белком, кавеолином, и что нарушения взаимодействия с кавеолином ингибирует одорант-индуцируемую продукцию цАМФ в обонятельных клетках. Кроме того, недавно идентифицировали ольфакторный белок, родственный стоматину (SRO) (), который, как показали, ассоциирует с липидными массивами (rafts) в ОЖ и связывается с кавеолином и АЦIII. Важно, что анти-SRO антитела стимулировали продукцию цАМФ в фракционированных цилиарных мембранах, означая, что rafts и/или кавеолин/липид/протеиновый комплекс регулирует обонятельную сигнализацию (Kobayawa et al., 2002). Ранние ультраструктурные данные из лаборатории Menco, сравнивающие мембраны ОЖ с мембраной респираторных ресничек, привели к выводу, что наружный листок мембран ОЖ толще, чем внутренний листок (Lidow and Menco, 1984). Это совпадает с возможным обогащением сфинголипидами, которые локализуются почти исключительно на наружных листках (Tillman and Cascio, 2003). Обогащение определенными липидами в дальнейшем поддерживается работой на беспозвоночных, которые показали, что цилиарная мембрана Paramecium высоко обогащена сфинголипидами (Andrews and Nelson, 1979). Эти исследователи показали, что возбудимость (excitability) циоиарной мембраны в такой же модели беспозвоночных была чувствительна к стерольному составу (Hennessy et al., 1983). Другие авторы отметили, что существует обогащение холестеролом в цилиарном стебле (shaft), но не в области ожерелья, эпителиальных ресничек, которые вытягиваются в ходе цилиогенеза (Chailley et al., 1983).

В своей работе Jenrins et al. (2009) описывают цилиарное ожерелье.

Обнаружен ясно очерченный микродомен, где липидная оболочка мембраны сходится с булавой. Эта мембранная специализация получила название «цилиарное ожерелье» и, вероятно, представляет собой переходную зону между цитоплазмой и цилиарным компартментом. Этот высоко упорядоченный домен характеризуется образующую спираль группой мембранных частиц (), которые связываются с базальным тельцем непосредственно под цилиарной аксонемой (). Хотя большинство типов ресничек имеют цилиарное ожерелье, обонятельные жгутики обычно имеют больше ниток бус на 1 ОЖ, чем респираторные реснички (Menco, 1980d). Образование цилиарного ожерелья предшествует цилиогенезу как пэтча мембраны, и у несформированных полностью ресничек еще существуют ожерелье-подобные структуры. Интересно, что обнаружили, что некоторые белки цилиарного транспорта локализуются на цилиарном ожерелье, включая те, которые могут служить в качестве cargo-docking сайта, связывающего цилиарную оболочку с протеиновыми комплексами в основании реснички (Deane et al., 2001).

Далее Jenkins et al. (2009) описывают базальные тельца (БТ).

БТ – модифицированая центриоль, которая мигрирует к ПМ до начала циоиогенеза (Рис.3). БТ are dublicared en masse в клеточном теле обонятельной клетки до того, как они мигрируют к булаве (Рис. 3А) (). БТ, как и аксонема ОЖ, состоит из 9 наборов МТ, сгруппированных в радиальной симметрии (Рис.1С). Однако БТ состоят из полимеров триплетных МТ γ-тубулина, а не из дублетных МТ из α- и β-тубулина, обнаруживаемых в аксонеме. БТ служат в качестве центра, организующего МТ (МТОС) в булаве, причем аксонемальные тубулы простираются из БТ так, что (+)-концы ориентируются к дистальной вершине ОЖ (Burton, 1992).

Помимо работы в качестве МТОС для цилиарной аксонемы, БТ связываются с электронно-плотными сателлитными частицами, которые, по-видимому, также являются МТОС (). Эти организующие центры служат в качестве сайтов нуклеации для МТ, которые проецируют из булавы обратно через дендрит к клеточному телу (). Некоторые из МТОС связываются с БТ через футляр материала, который окружает БТ и загустевает на своем проксимальном конце. БТ и футляр связываются с ПМ через 9 подпорок (struts), которые соответствуют электоронно-плотным окончаниям, которые заякореваются к ПМ (Рис.1С) ().

Далее Jenkins et al. (2009) описывают цилиарный корешок и цилиогенез.

Цилиарный корешок – харктерная черта цитоскелета, является основой для проекций из БТ во многих цилиарных клетках и участвет в заякоревании реснички (). Неясно, обладают ли корешками ОЖ (), однако, обонятельные клетки, как показано, экспрессируют компоненты цилиарного корешка в месте, совпадающим с областью булавы/базального тельца ().

Цилиогенез.

Впервые обонятельная плакода появляется у мышей на 9 эмбриональный день (Е9) после оплодотворения (). На Е10 обонятельная плакода инвагинирует () и образует обонятельную ямку, которая состоит главным образом из 2-х типов клеток: из электронно-плотной популяции (пролиферативные базальные клетки) и светлой (дифференцированные обонятельные клетки) (). На Е14 начинают образовываться дендрты и вытягиваться к апикальной поверхности. Обонятельная ямка также углубляется и образует вогнутости, которые в будущем будут превращаться в обонятельные turbinates (). В это время первичным сайтом роста и созревания обонятельных клеток являются глубокие углубления обонятельной ямки ().

К Е11 в обонятельной клетке появляются некоторые морфологические изменения, представляющие собой начальные стадии цилиогенеза. Во-первых, в перинуклеарной области этих обонятельных клеток образуются и вытягиваются вертикально к апикальной поверхности многочисленные МТ и микрофиламенты (Cuschieri, Banister, 1975a). Во-вторых, теперь дистальный конец дендрита протягивается к lumen носовой полости, где он начинает раздуваться и образовывать булаву (Рис.3 В,С) (). Наконец, и, возможно, самое главное, появляются дубликации центриолей, и группы центриолей аккумулируются в перинуклеарной области обонятельных клеток (Рис. 3А).

К Е12 увеличивается скорость пролиферации обонятельных клеток, и эти обонятельные клетки начинают проявлять хорошо сформированные дендриты и булавы, заполненные митохондриями, небольшими соated везикулами и многочисленными МТ (). МТ в булаве организованы двумя различными популяциями: одна организована концентрически вокруг периферии булавы, тогда как другая – продольно и выиягивается глубоко в дендрит (). Кроме того, центриоли, которые дублицировали в Е11, начинают мигрировать к булаве и, в конечном счете, рассосредотачиваются поодиночке вокруг периферии булавы, где они связываются с ПМ (Рис.3С). Цилиогенез начинается тогда, когда одиночные primary cilium приблизительно на 1мкм вытягиваются в носовую полость (). Когда образуются новые ОЖ, их аксонемы, образованные на основе МТ, удлиняются, а БТ, образованные мигрирующими центриолями, развиваются (созревают) и заякореваются к ПМ (Рис. 3С,D). К Е13 или Е14 можно видеть многочисленные ОЖ, вплоть до 2мкм в длину, вытягивающиеся из одной булавы (Рис.3D). В течение нескольких других дней ОЖ продолжают удлиняться и до рождения могут достичь 60мкм. В транспорте грузов, необходимых для роста и сохранения ОЖ, важную роль играет ИФТ (Reese, 1965; Seifert, 1971; Menco, Morrison, 2003).

Помимо цилиогенеза для нормальной обонятельной функции необходимо надлежащее снабжение цилиарными сигнальными белками. Большинство работ по исследованию экспрессии сигнальных молекул в процессе развития, проводили по экспрессии mРНК с помощью Reverse transcriptase polymerase chain reaction, northen blot или in situ гибридизации (). Интересно, что, по-видимому, существует различная временная экспрессия компонентов, необходимых для детекции одорантов. Обонятельные рецепторы, подмножество (subset) которых начинает экспрессироваться на Е11, по-видимому, являются первыми членами сигнального каскада, которые определяются по экспрессии mРНК и белков (). Эта экспрессия возникает до цилиогнеза, и таким образом, протеин обонятельного рецептора локализуется при высокой плотности в булаве (Schwarzenbacher et al., 2005). В конечном итоге, разнообразие экспрессии продолжает увеличиваться в ходе развития, таким образом, обеспечивая экспрессию сотен обонятельных рецепторов ().

Последующие за обонятельными рецепторами компоненты сигнального каскада экспрессируются в эмбриональном развитии, по-видимому, позже. Экспрессия АЦ III впервые определяется около Е15, тогда как Golf и cng-каналов – на Е16 и Е19, соответственно (Margali, Lancet, 1993). Считают, что детекция одорантов не может возникнуть до тех пор, пока в ОЖ не будут присутствовать все белки, однако уместность такого временного паттерна экспрессии остается неизвестной. Чтобы проследить цилиогенез, использовали экспрессию одного специфического обонятельного рецептора, mOR256-17 (Schwarzenbacher et al., 2004). Как упоминалось выше, обонятельные рецепторы начинают свою экспрессию до инициации цилиогенеза. mOR256-17 на этой стадии с высокой плотностью аккумулировался в булаве. Только после образования ОЖ и их удлинения обонятельный рецептор может правильно локализоваться (разместиться) сначала в булаве и на очень проксимальных частях ОЖ. Как только ОЖ достигнет 2 мкм в длину или длиннее (~Е12 – 13), mOR256-17 мигрирует почти исключительно в ОЖ (Schwarzenbacher et al., 2004). Интересно, что эта работа показывает, что, по крайней мере, для mOR256-17, часть может локализоваться в булаве независимо от какого-либо сигнала из ОЖ.

В работе Jenkins et al. (2009) рассматривается ИФТ.

Его рассматривают по аналогии с ресничками. Поскольку механизмы ИФТ очень консервативны не только между типами ресничек, но и между видами, авторы предположили, что эти механизмы, исследуемые на позвоночных, действуют также в ОЖ.

ИФТ вовлекает в ОЖ двунаправленный транспорт: в ОЖ и из него посредством использования молекулярных моторов, которые для генерации процессивного перемещения используют энергию гидролиза АТФ. Транспорт груза из ОЖ обратно в клетку совершается с помощью цитоплазматического динеина (), тогда как антероградный транспорт к дистальному (+)-концу цилиарных МТ, вовлекает кинезиновые моторы () (Рис.1D). Исследования Caenorhabditis elegans показали, что образование и сохранение аксонемы сенсорных ресничек и доставка груза осуществляется посредством координации двух антероградных кинезиновых моторов: гетеротримерного кинезинового мотора-II и гомомерного OSM-3 (Snow et al., 2004). Кинезин-II млекопитающих, состоящий из KIF3a, KIF3b и дополнительного белка KAP3, необходим для цилиогенза (Рис.1D) (Lin et al., 2003). Однако между специализированными цилиарными типами позвоночных и млекопитающих начинают распознавать различия (Ou et al., 2005; Jenkins et al., 2006). Экспрессия доминант-негативного KIF17 гомолога OSM-3 млекопитающих ослабляет цилиарный транспорт (движение) ольфакторных cng-каналов; однако это не влияет на длину ресничек, как это показано на C.elegans (). Интересно, что OSM-3 влияет на синглетные МТ в дистальных сегментах ресничек, как это показано на C.elegans (Ou et al., 2005). Так как ОЖ имеют такой же дистальный сегмент и некоторые сигнальные белки, включая cng-каналы, кажется вероятным, что KIF-17 также функционирует в дистальном сегменте ОЖ млекопитающих.

С помощью электронной микроскопии частицы ИФТ можно увидеть как электронно-плотные области, состоящие из моторов и комплесов ИФТ, обнаруженных вдоль аксонемы ОЖ (Reese, 1965). Известно, что моторы ИФТ ассоциируют с дыумя различными комплексами, состоящими из 17 высоко консервативных белков, названных комплексом А и комплексом В (Cole, 2003).

Комплекс А состоит из IFT 144, 140, 139, 122 и, вероятно, 43, тогда как комплекс В состоит из IFT 172, 88, 81, 80, 74/72, 57/55, 52, 46, 27 и 20. Дефекты в одном из комплексов могут ослаблять ИФТ и вызывать заболевания у человека, включая синдром Jeune, болезнь полицистозом почек, дегенерацию сетчатки и situs inversus (Blacque et al., 2008). Последнее сообщение показало, что мутация локуса, кодирующего гомолог IFT 88 у зебрафиш, приводила к потере ОЖ в обонятельных клетках (Tsujikawa, Malici, 2004). Некоторые протеины ИФТ очень гомологичны по механизму транспорта клатрина, локализованному в АГ (). Интересно, что клатриновый АР-1 μ адаптор, UNC-101, отвечает за локализацию (размещение) обонятельного рецептора в ОЖ C.elegans (Dwyer et al., 2001). Однако в боьшинстве случаев точная роль комплексов ИФТ в транспорте в ОЖ млекопитающих неясна.

Недавняя работа на С.elegancs показала, что существует динамическая реципрокность между цилиарной сигнализацией и сохранением цилиарной структуры, опосредованная ИФТ. Mukhopadhyay et al. (2008) показали, что потеря активации сенсорного сигнального каскада модулирует структуру модифицированных сенсорных ресничек в AWA-нейронах. Показано, что это зависимое от сигнального каскада сенсорное ремоделирование зависит от кинезина-II, а также белков синдрома Bardet-Biedl (BBS) (Mukhopadhyay et al., 2008). Это похоже на предыдущее исследование, показывающее, что структура ОЖ AWC-нейрона связана также с сенсорной функцией (Roayaie et al., 1998). Несмотря на многие пока нерешенные проблемы, эти указывают на возможную обратную связь между пртеинами ИФТ, вовлекаемыми в сборку и сохранение ОЖ, и протинами, вовлекаемыми в одорант-индуцируемую сигнализацию.

Авторы работы полагают, что обонятельные системы беспозвоночных не могут быть гомологичны обонятельным системам позвоночных (Northcutt, Gans, 1983). Кроме того, начинают определять различия даже между типами ресничек в пределах организма. Поэтому важно прояснить функцию ОЖ позвоночных и, особенно, млекопитающих.

Jenkins et al. (2009) рассматривают в работе селективность входа цилиарных белков.

Для всех организмов общим является тот факт, что доступ к ресничкам может получить только подгруппа клеточных белков, так как она состоит из белков, отличающихся от внеклеточного компартмента (Iglis et al., 2006). Полагают, что здесь должен быть барьер для диффузии, который ограничивает вход в ОЖ. Полагают, что эти селективные ворота возникают на БТ посредством взаимодействий с большим комплексом протеинов (Рис. 1D) (Rosenbaum, Witman, 2002; Scholey, 2003). Показано, что одно семейство протеинов, которое вовлекается в регуляцию цилиарного транспорта, это BBS семейство протеинов. BBS – это плейтропная цилиопатия, которая включает такие фенотипы, как дегенерация сетчатки, полидактилия, ожирение, аносмия и др. Существует 12 известных BBS-протеинов (BBS1 – 12), которые кодируют белки, вовлекаемые в различные стадии цилиарного транспорта. Потеря функции BBS1 и BBS4 вызывает ослабление обонятельной функции (Kulaga et al., 2004; Iannacone et al., 2005). Интересно, что нулевые мыши по BBS1 или BBS4 могут проявлять дефекты сохранения или сборки ОЖ, хотя механизм этого дефекта пока неизвестен.

Мутация cilia/centrosomal протеина СEP290 вовлечена в специфическую неправильную локализацию Golf (Mc Ewen et al., 2007). Важно, что мутация CEP290 глобально не изменяет структуру ОЖ, и все прочие изученные молекулы ольфакторной сигнализации локализуются нормально, означая, что в ОЖ регуляция входа грузов различна для различных протеинов. Интересно, что недавно показано, что СEP290 взаимодействует с соттелитным протеином центриоли PCM-1 в эпителиальной клеточной линии сетчатки (Kim et al., 2008). Показано, что PCM-1 взаимодействует с BBS4 (Kim et al., 2008) и зависит от присутствия BBS4 для правильной локализации в ОЖ (Kulaga et al., 2004).

Недавно показали, что протеин внутриклеточного транспорта, phosphofurin acidic cluster sorting protein 1 (PACS-1) локализуется в основании респираторных ресничек человека и контролирует локализацию нефроцистина 1 к переходной зоне респираторной реснички (Schermer et al., 2009). Хотя показано, что PACS-1 взаимодействует с такими содержащими кислые кластеры ионными каналами, как полицистин-2/TRPP2, TRPV4 и CLC7 (Kulaga et al., 2004; Youker et al., 2008), нет доказателства прямой роли в контроле локализации ионных каналов в цилиях. Показано, что этот протеин локализуется в булаве обонятельных клеток и необходим для локализации cng-канала, но не АЦIII в ОЖ. Интересно, что этот механизм зависит отфосфорилирования PACS-1 и CNG-B1b посредством СК2, таким образом обеспечивая механизм транспорта ольфакторного cng-канала, зависимого от субъединицы (Jenkins et al., 2006). Транспорт ольфакторных сигнальных белков, зависимый от фосфорилирования, может представлять механизм для настройки (регулирвки – timing) ольфакторной реакции.

Другое сообщение показало, что обнятельные рецепторы взаимодействуют с β-арестином по пути, зависимому от фосфорилирования, и что это взаимодействие может быть отвественным за транспорт обонятельных рецепторов из ОЖ при пролонгированном действии одоранта (Mashukova et al., 2004).

В настоящее время идентифицированы а/к-последовательности, необходимые для входа груза в ОЖ. Например, мотив “PV_xP”, сначала идентифицированный в полициcтине-2 (Geng et al., 2006), необходим для доставки ольфакторного cng-канала (Jenkins et al., 2996). Интересно, недавно показали, что гомологичный мотив “xV_x P” в родопсине взаимодействует с маленькой GTPазой Arf4 и регулирует транспорт цилиарного targeting комплекса из trans-Golgi network (Mazelova et al., 2009). Кроме того, некоторые обонятельные рецепторы содержат другой цилиарный targeting мотив, состоящий из (AX[S/A]XQ), которого достаточно, чтобы управлять локализацией нецилиарных рецепторов в цилии (Berbari et al., 2008). Интересно, что то, что только подгруппа цилиарных белков экспрессирует эти мотивы, означает, что существуют множественные потенциальные цилиарные targeting мотивы, которые наиболее вероятно действуют через различные механизмы входа в ОЖ.

Из-за отсутствия шероховатого ЭПР в булаве она не является сайтом для синтеза белков. Это означает, что цилиарные грузы должны синтезироваться в теле и транпортироваться вдоль дендрита для того, чтобы получить доступ к ОЖ. Поэтому потеря сомато-дендритического транспорта цилиарных грузов также может быть причиной цилиарных дисфункций. Например, у С. Elegans мутация мембранного протеина ODR-4 вызывает неправильную локализацию подгруппы хемосенсорных рецепторов (Dwyer et al., 1998). Из-за локализации ODR-4 во внутриклеточных мембранах в пределах сомы, авторы заключают, что эта неправильная локализация могла обусловливаться потерей ODR-4-опосредованной укладкой, сортировкой и транспортом обонятельного рецептора из сомы. Полагают, что обонятельные клетки млекопитающих обладают рядом похожих протеинов, необходимых для правильного транспорта обонятельных рецепторов.

В работе Jenkins et al. (2009) рассматривается динамика движения белков в пределах ОЖ.

Можно ожидать, что члены сигнальных каскадов, особенно трансмембранные белки, будут двигаться относительно медленно в ОЖ и проявлять длинные half-lives для того, чтобы увеличить эффективность сигнального каскада. Действительно, из экспериментов по восстановлению флуоресценции после фотовыгорания следует, что ольфакторный cng-канал двигается в пределах ОЖ со скоростью, совместимой с медленной диффузией (t_!/2 восстановления ~10 мин) в модельном эксперименте (Jenkins et al., 2006). Однако у С. еlegans TRP канал OSM-9 движется вдоль цилиарной мембраны со скоростью, сравнимой с ИФТ (~ 1 – 2 мкм ∙с^-1) (Qin et al., 2005). Одной из причин более быстрого движения груза в ОЖ может быть рециркулирование поврежденных мембранных белков.

В работе Jenkins et al. (2009) рассматривается судьба mistargeted цилиарных грузов. Как говорилось, БТ служит в качестве сайта нуклеации для цилиарной аксонемы и, возможно, служит в качестве scaffold для комплекса белков, которые регулируют вход груза в ОЖ. Кроме этих функций БТ действует такж как сайт организации протеолитического механизма. Например, показано, что вокруг центросомы обнаруживаются в большом количестве протеолитические ферменты (Wigley et al., 1999). Недавно показано, что нарушение функции БТ подавлением BBS4 ослабляет функцию протеосомы (Gerdes et al., 2007). Этот БТ/протеосомный комплекс может служить для того, чтобы разрушать неправильно сложенный или гнеправильно транспортируемый цилиарный груз. Например, мыши, нулевые по CNGB1b, проявляют очень низкие уровни остающихся CNG-субъединиц (Michalakis et al., 2006). Однако когда этих мышей обрабатывают ингибиторами протеосом, остающиеся канальные субъединицы можно легко определить в булаве, что охначает, что булава служит как сайт протеолитической деградации.

В работе Jenkins et al. (2009) рассматриваются цилиарные геномики и протеомики.

Ресничка содержит ряд белков, отличных от remainder клетки (Inglis et al., 2006). Кроме того, компоненты, необходимые для детекции одорантов, высоко локализованы в ОЖ (Рис.2). Последние технологические достижения в значителной степени обогатили нашу способность использовать биоинформатику в качестве инструмента для идентификации новых генов, вовлекаемыхв такие клеточные процессы, как образование и функция ресничек. Недавно идентифицировали сотни генов, которые присутствуют у многочисленных ресничатых видов, которые важны для функций, имеющих отношение к ресничкам (Avidor-Reiss et al., 2004; Li et al., 2004; Pazour et al., 2005; Smith et al., 2005; Stole et al., 2005; Blacque et al., 2006; McClintock et al., 2008).

Хотя считают, что реснички широко консервативны между типами ресничек, сейчас становится ясно, что существуют различия, как между видами, так и между типами ресничек в одном и том же организме. Только очень мало исследований сконцентриоовано на идентификации цилиарных генов у млекопитающих, причем только несколько фокусируется на ОЖ (Ostrowski et al., 2002; Su et al., 2004; Sammeta et al., 2007; Klimmeck et al., 2008; Mayer, Kuller et al., 2008; Mayer, Ungerger et al., 2008; McClintock et al., 2008). Используя геномики и протеомики, эти исследователи идентифицировали сотни генов, связанных с ОЖ, с известной и неизвестной функцией в обонятельных клетках.

В работе Jenkins et al. (2009) рассматриваются ОЖ и болезни человека.

Хотя обонятельная система необходима для обнаружения запахов и важна для нашего ощущения вкуса, она играет важную роль также в качестве нашей жизни, здровоье и безапасности (благополучия). Дизосмия (снижение чувства обоняния) или аносмия (потеря способности обонять) не позволяют нам определять такие признаки опасности, как дым (курение) или испорченная пища, также может привести к таким медицинским проблемам, как избыточный вес и бедное питание (Toller, 1999). Оценивали сниженную ольфакторную функцию, которая затронула 3 – 6 млн американцев, и более 50% из них в возрасте более 65 лет (Murphy et al., 2002; Nguyen-Khoa et al., 2007), однако эти цифры могут характеризовать недооценку, так как о многие не сообщают об обонятельной дисфункции (Nguyen-Khoa et al., 2007). Хотя основными причинами нарушения обоняния у пациентов являются повреждения из-за травмы головы, инфекции верхних дыхательных путей и хронические риносинуситы, ~ 20% случаев этиология, лежащая в основе заболевания, остается неизвестной (Jafek, 2000).

В работе Jenkins et al. (2009) рассматриваются ольфакторные цилиопатии.

Он говорит, что в работах Douek et al. (1975) и Afzelius (2004) у пациентов с врожденной аносмией брали биопсию, что показало, что хотя общая архитектура эпителия выглядела нормальной, его обонятельные клетки лишены ОЖ, причина чего неизвестна (Duec et al., 1975). Только за последние 5 лет точно идентифицированы пациенты с дефектами обоняния из-за дефектов ОЖ (Kulaga et al., 2004; Iannacone et al., 2005; McEven et al., 2007). В этих случаях обонятельные дефекты возникают при двух различных pleiotropic заболеваниях, BBS и Leber congenital amaurosis (LCA) (врожденная слепота Leber).

BBS – высоко прлейоторопна у пациентов, проявляющих умственную отсталость, ожирение, дегенерацию сетчатки, полицистоз почек, гипертонию и гиперхолестеролемию, что вместе может приводить к преждевременной смерти (Bardet, 1995; Biedle, 1995; Beales et al., 1999; Klysik, 2008). Различные эффекты зависят от мутации в 1 из 12 членов генного BBS семейства, причем большинство жестких мутаций возникает или в BBS1 или в BBS10 (). Некоторые белки BBS – BBS1 – 8, охарактеризованны как протеины БТ, которые регулируют вход протеинов в ОЖ (Klysik, 2008). Мутации у 2 BBS протеинов человека, BBS1 и BBS4, и делеция генов BBS1, BBS2 или BBS4 у мышей приводили в результате к резкому снижению ольфакторной функции (Kulaga et al., 2004; Mykytin et al., 2004; Nishimura et al., 2004; Iannacoone et al., 2005). Однако мутации протеинов BBS не разделяют общего механизма, лежащего в основе ольфакторной дисфункции. Например, пациенты с мутациями BBS1 аносмичны главным образом из-за потери ОЖ, так как ОЖ отсутствуют в модели BBS1-нулевых мышей (Kulaga et al., Iannacoone et al., 2005). У BBS2-нулевых мышей статус ОЖ не исследован, но ренальные и ретинальные реснички к своей сборке способны (Nishimura et al., 2004). Наконец, в двух различных исследованиях пациенты с мутацией BBS4 имели пониженное обоняние или аносмию (Kulaga et al., 2004; Iannacoone et al., 2005). Дивергентные фенотипы, наблюдаемые при мутации или потере специфических BBS-протеинов, выдвигают на первый план сложную регуляцию цилиогенеза, а также сборку и сохранение аксонемы. Это также справедливо при сравнении различных цилиарных клеток у животных, нулевых только по BBS. Например, мыши, дефицитные по BBS4, имеют уменьшенный цилиарный слой в ОЭ, что является причиной почти полного отсутствия реакций в ЭОГ (Kulaga et al., 2004). Подобно этому, сперматозоиды у этих нулевых мышей полностью теряют флагеллу (Mykytin et al., 2004). Однако эти мыши еще способны к цилиогенезу (Mykytin et al., 2004). Ренальные эпителиальные клетки от этих животных имеют реснички, но проявляют измененный timing (координация, синхронность, выбор определенного времени) для вытягивания аксонемы (Mokrzan et al., 2007), что может допустить зависимый от возраста полицистоз почек (Eichers et al., 2006). Эти результаты демонстрируют чувствительность различных клеотчных типов к изменению функции BBS и означают, что проявление заболевания может отражать степень, с которой общее развитие нормальных цилий для фенотипа широкого типа.

Второй пример цилиарного дефекта, приводящего к ослаблению обоняния, это недавнее исследование ольфакторной функции у пациентов с LCA (McEven et al., 2007). LCA, впервые открытое Theodor Leber почти 140 лет назад (Leber, 1869), является врожденной дистрофией сетчатки, объясняющей более 5% унаследованных ретинопатий (Koenekoop, 2004). LCA может возникать из-за мутаций нескольких протеинов с разнообразными функциями, от обеспечения метаболизма и фототрансдукции в сетчатке до последовательности (progression) клеточного цикла (Koenekoop, 2004). Последние сообщения показали, что LCA может возникать в результате мутаций в протеине центросома/БТ, CEP290 (denHollander et al., 2006; Cideciyan et al., 2007). Ольфакторную функцию тестировали у оригинальной популяции пациентов с LCA с мутациями в CEP290 с помощью Brief Smell Identification Test (McEwen et al., 2007). У всех протестированных пациентов мутац в CEP290 приводили в результате к резкому ослаблению обонятельной функции, несмотря на самооценку нормального чувства обоняния. С помощью можели на мышах определили, что ослабление обоняния обусловливалось неправильной локализацией (mislocalisation) Golf, делая (rendering) сигнальный путь нефункциональным несмотря на то, что ОЖ оставались интактными (McEwen et al., 2007). Таким образом, обонятельная функция из-за дефектов ОЖ может возникать по 2 разным механизмам: 1) полная потеря ОЖ и 2) дефект транспорта белков, приводящий к потере ольфакторной сигнализации.

Хотя теперь ясно, что ольфакторная дисфункция является клиническим выражением погруппы цилиопатий, по-видимому, существует селективное проникновение (penetrance) фенотипов между различными ресничками в теле. Например, гипоморфная мутация CEP290 вызывает аносмию и рано начинающуюся дегенерацию сетчатки без почечного проявления (фенотипа) (Chang et al., 2006; McEven et al., 2007). Кроме того, KIF17 не нужен для сохранения ресничек почек, однако он необходим для вытягивания наружного сегмента палочек, который является вытяжением (расширением – extension) модифицированной соединяющей реснички (Jenkens et al., 2006; Insinna et al., 2008). Несмотря на разнообразное pentrance цилиопатий, оценка ольфакторной функции представляет привлекательный инструмент для прегенетического скрининга благодаря низкой стоимости и минимально инвазивной природы процедуры.

В работе Jenkins et al. (2009) рассматриваются обонятельные клетки как сайты для входа патогенов.

Обонятельная система млекопитающих уникальна в том, что является единственной областью ЦНС, на которую непосредственно влияет окружающая среда (Doty et al., 1991; Doty, 2008). Рассчитали, что поверхность ОЭ, состоящая из булав и ОЖ, на которую оказывается влияние, составляет ~ 23 см² (Doty et al., 1991; Doty, 2008). Все это делает ОЭ уникальной и уязвимой мишенью для входа патогенов непосредственно в мозг. Даже если ОЭ частично защищается наличием слизи, а также высокими уровнями метаболизирующих энзимов, таких как цитохром Р₄₅₀, существуют доказательства, что патогены могут входить в мозг через ОЭ (Baker Genter, 2003; Ding, Dahl, 2003; Doty, 2008). В начале 20в. показали, что вирусы могут входить в мозг обезъян, и что распространение инфекции можно предотвратить повреждением ОЭ, аксонных трактов или ОЛ (Flexner, 1917; Doty, 2008). Одним из вирусов, который проникает в мозг через ОЭ, является вирус полиомилита (). Теперь это – аденовирусы, herpes simplex, гепатит, вирус гриппа А, бешенство и мн. др. (Doty, 2008). Подгруппа этих патогенов может входить исключительно через обонятельные клетки, особенно через ОЖ. Например, пациенты с sporadic Creutzfeld-Jokob болезнью положительны к protease-resistant prion protein (Tabaton et al., 2004). Посмертное исследование нейропатологии показало потерю нервов и gliosis в церебральной коре, мозжечке и стриатуме, означая, что ОЖ служат в качесиве сайта для входа патогенов (). Поэтому ОЭ, особенно ОЖ, вероятно, являются основной мишенью для патогенетической трансмиссии ксенобиотиков непосредственно в мозг.

Итак, ольфакторная дисфункция в основной популяции имеет высокую частоту, охватывая ~2,5 млн. человек в США. Приблизительно в 20% случаев этиология хемосенсорных нарушений не идентифицирована. Получены доказательства, что ольфакторная дисфункция является клиническим проявлением появляющегося класса гентических расстройств человека, называемого цилиопатиями, которые вызывают дефекты цилиарной сборки и/или транспорта белков. При наличии пластичности в ольфакторной системе и ее регенеративных свойств, обонятельные клетки испытывают непрерывный процесс цилиогенеза и транспорта белков, которые являются важными для обонятельной функции. В обонятельных клетках присутствуют внутренние механизмы, которые регулируют локализацию к клеточной поверхности и селективную цилиарную компартментализацию белков обонятелной трансдукции. Однако механизмы и молекулярный аппарат, необходимый для цилиарного транспорта в обонятельных клетках, мало изучены.

Grubb B.R. et al. (2007) показали, что у мышей с муковисцедозом в ольфакторном эпителии обнаруживаются прогрессивные функциональные и морфологические дефекты. В нормальном эпителии обонятельные рецепторные клетки постоянно замещаются путем дифференцирования клеток-предшественников. Морфологические исследования методом световой микроскопии показали, что обонятельный эпителий у мышей с муковисцедозом не проявляет аномалий при рождении, но с возрастом (начиная уже с 30-дневного срока) заметно нарушается морфология опорных клеток и драматическое снижение обонятельных рецепторных клеток.

Авторы методом световой микроскопии показали, что у мышей с муковисцедозом отсутствуют ОЖ. Методом иммуноокрашивания ольфакторным маркерным протеином показали, что у этих мышей снижено количество рецепторных клеток. Вместе с тем число опорных клеток и их морфологичское строение у них не изменялось по сравнению с мышами дикого типа. Эти данные они подтвердили и с помощью электронной микроскопии. Полагают, что с CF-мышей опорные клетки могут увеличиваться в размере, чтобы заполнить простанства, оставленные дегенерирующими обонятельными клетами. С возрастом также снижается число рецепторных клеток, а объем опорных клеток увеличивается (даже в норме). В норме обонятельные клетки способоны не только восстанавливать свою популяцию после повреждения, но и функцию. В ОЭ CF- мышей, как полагают, не смотря на наличие слоя интактных базальных клеток, обонятельные клетки либо не регенерируют, либо дегенерируют с гораздо большей скоростью, чем восстанавливаются.

В работе ссылаются на данные, в которых показано, что отсутствие в мембране ОЖ таких компонентов сигнальной трансдукции, как АЦ III или Golf или CNG-каналы приводит к смерти мышей с удаленными генами этих белков при рождении. При этом гистологическое строение ОЭ у этих мышей в норме. У CF-мышей ОЭ дегенирирует с возрастом, что связано, вероятно, с прогрессирующей дегенерацией обнятельных клеток.

Кроме того, в работе показано, что в ОЭ CF-мышей скорость всасывания Na в 12 раз выше, чем у животных дикого типа. Показано, что микровиллы опорных клеток содержат амилорид-чувствительные Na-каналы. Поэтому полагают, что именно опорные клетки в ОЭ CF-мышей являются сайтом гиперабсорбции Na, а следовательно, именно в их мембране сосредоточены CFTR, а следовательно, в них находится дефект хлорной проводимости, обеспечивающей цАМФ-индуцируемую секрецию хлора.

Электрофизиологические исследования посредством регистрации ЭОГ показали, что морфологическая дегенерация ОЭ при муковисцедозе приводит к потере обонятельной функции у этих мышей, поскольку ЭОГ не регистрировалась даже при сильной стимуляции одорантами (10^-3 М ацетофеноном и 7-al гептальдегидом (7AL)). Дефицит обоняния у этих мышей увеличивается с возрастом вплоть до 65 – 70% по сравнению с животными этого же возраста, но дикого типа.

Показано, что дегенерация ОЭ у мышей с муковисцедозом – это результат отсутствия у них в ОЭ CFTR, который экспрессируется в ОЭ мышей дикого типа.

При исследовании мерцательного эпителия дыхательных путей показано, что муковисцедоз является результатом мутаций регуляторного протеина трансмембранной проводимости при муковисцедозе (CFTR), цАМФ-активируемого Cl-канала. Отсутствие функционирования CFTR приводит к нарушению ионного транспорта (отсутствию Cl-секреции и увеличению всасывания Na), что вызывает высушивание слизи на поверхности дыхательного эпителия и тяжелые легочные заболевания.

Исследования авторов показали отсутствие у этих мышей стимулируемой форсколином секреции хлора и 12-кратное увеличение всасывания амилорид-чувствительного натрия по сравнению с мышами дикого типа. Согласно гипотезы, выдвигаемой авторами, значительное гипервсасывание натрия наиболее вероятно опорными клетками приводит к высушиванию поверхностного слоя, в котором находятся ОЖ, вслед за которым происходит дегенерация рецепторных клеток.

Авторы полагают, что у CF мышей происходит не только высушивание, но и изменение состава слизи, что также может вносить вклад в повреждение ОЖ.

Авторы приводят примеры потери обоняния у человека с муковисцедозом (средний возраст 28 лет).

По мнению авторов, ОЖ у мышей длинные (до 200 мкм), неподвижные, тянутся от булавы и лежат в слое обонятельной слизи параллельно поверхности ОЭ, образуя плотный слой толщиной около 3,3 мкм. Кроме воздействия вдыхаемых пахучих веществ на ОЖ действуют различные токсические вещества, изменение влажности и турбулентности вдыхаемого воздуха. Обонятельная слизь защищает их от высушивания и турбулентного потока воздуха.

Рецпторные клетки окружены опорными. Им присущи различные функции, включая структурную поддержку обонятельных клеток, биотрансформацию ядовитых веществ, фагоцитоз, векторный транспорт калия и поддержание солевого баланса в слизи, окружающей ОЖ (29, 35). Если опорные клетки вовлекаются в поддержание водно-солевого баланса слизи, то нарушение ионного транспорта в них может изменять этот баланс, подвергая риску целостность структуры и функции обонятельных рецепторных клеток. Что и показали авторы в своей работе.

Menco B.P.M. et. al. (1978). (СМ. ХОРОШИЕ ФОТО ОЖ – в папке для рис.). В своей работе посредством высоковольтной трансмиссионной электронной микроскопии и криоультрамикроскопии исследовали поверхность обонятельного и респираторного эпителия быка. Показали, что ОЖ суживаются в области дистального сегмента. Эти методы выявляют вертикальное и горизонтальное расположение ОЖ на поверхности ОЭ. При этом как проксимальные, так и дистальные участки образуют параллельные пучки (СМ. РИС.). Иногда пучки дистальных сегментов образуют петли. Этими методами в основании проксимальных сегментов обнаружены цилиарные ожерелья. Кроме того, выявляются и микровиллы на поверхности ОЭ. Они принадлежат опорным клеткам и располагаются перпендикулярно ОЖ.

Показали, что ОЖ образуют плотный слой, покрывающий поверхность ОЭ. У ряда макросматиков млекопитающих длина ОЖ достигает 50 – 60 мкм. Роль ОЖ в том, что они обеспечивают средство для расширения области рецептороной поверхности. Так, на площади ОЭ быка в 1 см² рецепторная поверхность в сумме составляет около 20 см²/см². Образование петель на концах ОЖ, которые наблюдал автор, он объясняет наличием случайного препятствия цилиарному отростку, например, посредством вязкостного барьера.

В работе А.И. Бронштейна (1950) сказано, что при вдыхании струя воздуха минует верхний носовой ход, в котором располагается обонятельный эпителий. Узкая обонятельная щель между верхней раковиной и перегородкой лежит вне основного потока вдыхаемого воздуха. Этот воздух может при спокойном дыхании достигнуть обонятельной области лишь путем диффузии. Интенсивное втягивание носом приводит к образованию турбулентного потока в узких носовых ходах. По-видимому, в этом случае имеет значение такое сужение носовых отверстий благодаря изменению положению крыльев носа. Сужение отверстий способствует ускоренному протеканию воздуха и образованию вихрей, а также меняет направление воздушной струи. Острота обоняния левой половины носа больше, чем правой: у большинства людей носовая перегородка слегка искривлена вправо.

Обзор Zelan c., Sobel N. (2005). Человек обладает экстраординарным чувством запаха (). Так, не только собака человека, но и человек свою собаку может идентифицировать по ее запаху (). Мать человека может идентифицировать своего ребенка по запахау () и человеческий детеныш может идентифицировать запах кормящей грудью матри через 6 дней после рождения (). Человек способен определить запах этил-меркаптана в концентрации 1 части на биллион (ppb) (миллиард), обычно 0,2ppb (). Это эквивалентно определению около 3 капель одоранта в бассейне олимпийского размера. При сравнении двух бассейнов человек может определить, в каком из них содержится 3 капли одоранта. Люди не только врожденно хорошо определяют запахи, но способны совершенствоваться с опытом. Повторная практика при определении одоранта может значительно снижать пороги определения данного одоранта, эффект которого значительно сильнее у женщин, чем у мужчин (Dalton et al., 2002). Кроме того, по крайней мере для запаха андростенона, люди, которые были совершенно неспособны ощущать его, развивают эту способность после повторного предъявления ().

Интересно заметить, что при оценке порогов ольфакторного ощущения необходимо учитывать поведенческую уместность данного одоранта, поскольку пороги для одного и того же запаха, но для разных животных (даже при сравнении обезъяны и человека) могут быть разными (). Кроме того, пороги ольфакторного ощущения одоранта, который предъявляют, как правило 1 – 2 раза, могут значительно снизиться при многократном его предъявлении.

Помимо небольшой разницы в концентрации люди могут различать мельчайшие изменения в молекулярной структуре. Например, человек может различать алифатические одоранты с одинаковым числом атомов углерода, но различающихся по функциональной группе (Laska et al., 2000). Самое удивительное, что человек может различать одоранты, которые различаются по длине цепи на 1 атом углерода, и чем больше разница в длине углеродной цепи, тем легче они различаются (Laska, Freyer, 1997). Еще более удивительно, что человек способен различать опредленные enantiomer пары типа (+) и (-) карвон. Однако человек наделен слабой способностью определять названия запахов (идентифицировать их). Он запах может хорошо описать, но не может назвать. Часто пользуются стандартными тестами, наиболее распространенными из которых являются “University of Pennsylvania Smell Identification Test (UPSIT), (Doty et al., 1984b).

Часто для описания запаха человек использует приятность или неприятность его восприятия. Показано, что приятность является основной величиной ольфакторного перцептуального пространства.

Из статьи Шепелевой В.К. (1971) следует, что остроту обоняния у людей и животных определяют по порогам восприятия запахов. Люди примитивной культуры по остроте обоняния превосходят цивилизованных. Собака менее чувствительна к растительным запахам и более – к веществам животного происхождения (моча, кровь, мясо). Для раздражения клетки обонятельного рецептора собаки достаточно 1 молекулы пахучего вещества, обонятельная способность собаки в миллион раз выше, чем человека. Собака способна анализировать сумму запахов и выделять запах хозяина.

Степень чувствительности к запаху прямо пропорциональна числу углеродных атомов в пахучей молекуле. Деятельность обонятельного анализатора можно усиливать специальными средствами. Так, фенамин, кофеин и бром стимулируют его деятельность, повышая остроту обоняния у собак. Действие фенамина продолжается в течение нескольких часов. Смесь фенамина с кофеином усугубляет действие фенамина, а смесь с бромом улучшает дифференцирование веществ. Обонятельная рецепция отличается дистантностью. Так, лисицы способны улавливать очень слабые запахи: они отыскивают под снегом грецкие орехи на глубине 70 – 80см, пакетики с фисташками – на глубине 4 – 5см. При почти полном отсутствии потоков воздуха дистантность обонятельного рецептора у собак незначительна и практически определяется силой втягивания воздуха в легкие. Комплексные запаховые раздражители собаки воспринимают как особые целостные раздражители, а не как сумму отдельных компонентов. Обонятельные раздражители являются слабыми компонентами комплексных раздражителей и, входя в состав сложных комплексов, подвергаются отрицательному индукционному влиянию со стороны более сильных компонентов, например, звука.

Под влиянием таких запахов, как бергамотное масло, гераниол и камфора увеличивается чувствительность зеленоощущающего аппарата зрения у человека и снижается чувствительность его красноощущающего аппарата. Запах камфоры связывается с холодом, а запах аммиака – с болью. Запахи влияют также на различные физиологические процессы. Под влиянием запаха мяты и гаультерового масла и вонючей смолы у кроликов снижается газообмен, а запах мускусау увеличивает обмен веществ.

Из обзора Elsaesser R., Raysan J. (2007) следует, что для того, чтобы обеспечивать высокую чувствительность обонятельной сенсорной системы, необходимо максимизировать динамическую чувствительность обонятельных клеток. По мнению авторов, динамическая чувствительность представляет собой способность сигнальной системы отвечать на маленькое изменение входного сигнала модуляцией выходного сигнала по статистически значимому пути. На динамическую чувствительность обонятельной клетки непосредственно влияет размер поверхности ее апикального мембранного компартмента, так как последняя коррелирует с числом сигнальных протеинов и таким образом, с тотальным количеством элементарных реакций (ответов, которые могут одновременно генерироваться в каждой клетке).

В обонятельной сенсорной системе снижение шума – многоуровневый процесс (). Он начинается с нелинейного сигнального усиления Са-активируемыми хлорными токами (), продолжается конвергенцией массой ОЖ на булаву апикального дендрита обонятельной клетки и далее усложняется конвергенцией сотен обонятельных клеток на одиночную гломерулу в ОЛ (). Эта многоуровневая интеграция с возможностью приспособления порогов на каждом уровне делает возможным эффективную фильтрацию фонового шума, что отмечается как внутреннее свойство ольфакторной сигнальной трансдукции (). Для данной концентрации одоранта и сродства одоранта к рецептору суммарная эффективность обонятельной клетки как целого будет непосредственно зависеть от общего числа представленных рецепторов. Так как существует лимит плотности упаковки рецепторов и других сигнальных молекул в пределах мембранной поверхности, эти параметры будут зависеть также от общей апикальной поверхности мембранной области. Поэтому обонятельные клетки увеличивают площадь поверхности, образуя из апикальной мембраны ОЖ и /или микровиллы (). Кроме того, время жизни рецептор-одорантного комплекса очень короткое, что дает возможность повторного связывания молекул одоранта с тем же рецептором. Кроме того, quantal реакции обонятельных клеток очень маленькие. В то же время плотность рецепторов в цилиарной мембране такая высокая, что их область реакции перекрывается, что вызывает нелинейную суммацию индуцируемых одорантами унитарных реакций ().

Обоняние влияет также на поведение животных и человека. Экстерпация передних носовых раковин у щенков и крольчат вызывает недоразвитие половых органов.

А.И. Бронштейн (1950) пишет, что область, покрытая ОЭ, сравнительно легко доступна со стороны задних отверстий – хоан. Поэтому пахучие вещества, попадающие в рот, могут вступить в контакт с обонятельными клетками. Особенно благоприятные условия для этого создаются во время глотания. Однако эффект действия обонятельных веществ при выдохе оказывается в 3 – 4 раза слабее, чем при вдохе.

По мнению автора, можно считать единственно установленным адекватным раздражителем органа обоняния – пары пахучих веществ. При этом разные вещества ощущаются при разной концентрации. Так, запах скатола ощущается при наличии в 50 куб.см воздуха, вдыхаемого через нос, только 0,00000000002г вещества; запах этилмеркаптана – 0,0000000000022г; запах тринитробутилтолуола – 0,00000000000025г. Оказывается, что количество пахучих молекул этих веществ, попадающих в нос, все же огромно, даже если учесть, что в верхний носовой ход попадает только 0,01 или 0,001 часть воздуха, проходящего через нос. Так, число молекул скатола в 50 см³ воздуха при пороговой концентрации равно 9,2х10¹⁶ молекул; этилмеркаптан – 1,9х10¹⁰ молекул, а тринитробутилтолуол – 5,4х10⁸ молекул. Для возбуждения обоняния обычно требуется меньшее количество крупных молекул, чем мелких.

В своей книге автор пишет, что вопрос о соотношении запаха и химической структуры очень сложен. Трудно, например, объяснить, почему пороговые концентрации амилового и изоамилового спиртов отличаются в 10 раз, а бутилового и изобутилового равны между собой. Автор отмечает, что чрезвычайно отчетливо выражена адаптация к запахам. Различают гомогенную и гетерогенную адаптацию. Гомогенная адаптация – это изменение чувствительности к тому запаху, который действует на обонятельные рецепторы. Гетерогенная адаптация – это изменение чувствительности к запаху других веществ. Для гомогенной адаптации показано: во время пребывания в атмосфере, содержащей значительное количество паров того вещества, запах которого здесь же и определяют, чувствительность к этому запаху падает (до 26 – 30%). Через 1 минуту после выхода из этой атмосферы чувствительность повышается, но остается пониженной по сравнению с нормой. Запах многих веществ по прошествии короткого промежутка времени может полностью исчезнуть. Другие вещества для этого требуют гораздо больше времени. К некоторым веществам адаптация не наступает. Длительность промежутка времени (мин.), необходимого для полной адаптации, для: цитрал – 4 – 5 мин., камфора – 2 – бесконечность.

Особенностью процесса обонятельной адаптации является наличие не только количественных (увеличение порогов), но и качественных изменений ощущений. Запах многих веществ изменяет свой характер при вдыхании его в течение длительного промежутка времени. Так, пропионовая кислота утрачивает свой уксусный запах, а прогорклый компонент становится более отчетливым. Нитробензол запах горького миндаля меняет на запах резины, а триметиламин при больших концентрациях рыбный запах – на аммиачный. Акриловая кислота чесночный запах меняет на эфирный так же, как и меркаптан. Изменение запаха пахучих веществ в процессе адаптации к нему можно сопоставить с изменением запаха некоторых веществ при снижении их концентрации. Многие вещества способны действовать различно на орган обоняния в различных разведениях. Например, ионон в больших концентрациях имеет смолистый запах типа запаха кедрового дерева. Если долго нюхать, он приобретает запах фиалки. В маленьких концентрациях он также обладает запахом фиалки. Если ионон нюхать при малой концентрации, фиалковый компонент ослабевает. При предъявлении большой концентрации ощущается чисто кедровый запах. Такие же отношения обнаруживаются при нюхании мускуса, терпинеола и ванилина.

Обзор Zelan C., Sobel N. (2005). С помощью ЭОГ авторы изучали процесс адаптации в обонятельной сенсорной системе человека (ослабление ответа при повторном предъявлении) (). Сравнивали ЭОГ с оценкой ощущаемой интенсивности при повторном предъявлении стимула (Hummel et al., 1996). Оказалось, что при повторной стимуляции одорантом ответ ОЭ снижался всего на 20%, тогода как оценка человеком интенсивности снижалась почти на 60%. Следовательно, центральный компонент адаптации аппарат вносит больший вклад в оценку адаптации, чем периферический. Таким образом, психифизиологическая оценка процессов адаптации в обонятельной сенсорной системе эффективнее, чем оценка нейрональной активности с помощью ЭОГ.

Гетерогенная адаптация – это адаптация к запаху одного вещества снижает чувствительность к запаху другого вещества, но незначительно. Сдвиги чувствительности зависят от концентрации паров тех веществ, к которым произошла адаптация. Адаптация к ним по разному изменяет пороги различных веществ.

Сенсибилизация обоняния. Показано наличие процесса сенсибилизации в органе обоняния. Важнейшее условие, вызывающее сенсибилизацию, - это многократное действие на рецепторы слабых пороговых стимулов, наносимых через определенные промежутки времени. При сенсибилизации к запаху одного вещества можно отметить некоторое увеличение чувствительности и к запахам других веществ, однако в разной мере к разным веществам. Сенсибилизация проявляется отчетливо в отношении запахов более или менее близких по своему характеру к сенсибилизировавшему, и проявляется сравнительно незначительно в отношении запахов, резко от него отличных. Если проводить опыты с сенсибилизацией к определенному запаху в течение нескольких дней подряд, это приводит к стойкому снижению порогов восприятия данного запаха (увеличение возбудимости, чувствительности). Возможно, что на этом основана так называемая “тренеровка” органа обоняния, в результате которой чувствительность может увеличиваться к некоторым запахам и удерживаться от 7 до 22 дней. Причем эта чувствительность становится еще более стойкой после проведения повторных тренеровок.

(Обзор Zelan C., Sobel, N., 2005). Показали также, что способность ощущуть человеком запах, ранее не ощущаемый (андростенон), возможна за счет пластической способности на уровне ОЭ. Повторное воздействие одорантом может инициировать или снижать экспрессию одного или нескольких типов рецепторов (Mainland et al., 2002; Wong et al., 2004; Yee, Wysocki, 2001; Wysocki et al., 1989). В дальнейшем повторные сигналы, поступаемые от рецепторных клеток в ОЛ, обеспечивают способность воспринимать их на центральном уровне анализатора, таким образом увеличивать способность мозга вырабатывать чувство к ранее неощущаемому сообщению.

Методы исследования обонятельной функции.

Диагностика обонятельных нарушений.

Эти вопросы обсуждаются в работе Овчинникова Ю.М. и др. (1999).

1. Методы ольфактометрии – оценка остроты (порогов обоняния).

Для этих целей используют количественные методы ольфактометрии, предполагающие использование пахучих веществ различной концентрации, либо ольфактометров – приборов, позволяющих более точно дозировать интенсивность раздражителя. Тестирующие вещества используют в возрастающей концентрации.

До настоящего времени остается нерешенной проблема определения обонятельного порога – минимального количества и концентрации пахучего вещнства, вызывающего возбуждение ОА. Не унифицирована методика определения обонятельных порогов. Недостатками имеющихся методик является неадекватная техника регистрации, получение результатов, основанных на получении субъктивной оценке раздражителя, недостаточная степень очистки используемых пахучих веществ. Важно использовать дифференциальные пороги обоняния – минимально ощутимые приращения концентрации пахучих веществ. Применяют метод вынужденного выбора в 2-х или 4-хальтернативном эксперименте. Проводят процедуры тестирования, основанные на большом числе повторных испытаний, в частности, так наз. «лестничная» процедура, при которой после правильного ответа концентрация стимула снижается, а после ошибочного ответа повышатся. При высоких концентрациях величина дифференциального порога увеличивается.

Для исследования способности к узнаванию запаха (для грубой оценки их восприятия) используют стандартные образцы для одноразового использования, разработанные в Университете в Пенсильвании. Этот набор из 40 тестируемых запахов. В Японии широкое применение нашел метод исследования обоняния, основанный на в/в введении раствора пахучего вещества (препарата ВитВ с характернвм запахом): метод «гематогенного обоняния».

Исследование различения пахучих веществ:

Запахи ольфакторного действия – водный экстракт валерианы, ванилин, масло укропа, гвоздика, молотый кофе, корица, розовое масло, деготь.

Запахи ольфакто-трегиминального действия – ментол, ацетон, этиловый спирт, камфорное масло, формальдегид, 5% раствор йода, 2% раствор аммиака.

Запахи ольфакто-глоссофарингеального действия: 5 – 7% раствор уксусной кислоты, хлороформ, пиридин, подоформ.

Полагают: ольфакторное действие присуще веществам, выделенным в химически чистом виде.

В оценке обонятельных порогов имеет определенное значение явление обонятельной адаптации. Адаптация зависит от интенсивности стимула, его продолжительности и качества.

Восстановление обонятельной чувствительности составляет не около нескольких минут. Это значительно превышает соответствующие значения для органа слуха. Особенность восприятия пахучих веществ (смесей) – слияние запахов с ощущением нового запаха, частично сходного с компонентами пахучей смеси; смешение типа «музыкального аккорда», когда все компоненты могут быть выделены, но воспринимаются в сочетании; чередование обонятельных компонентов; маскировка одним запахом других.

Метод ольфактометрии требует усовершенствования. Он должен быть адекватным, сочетать качественные и количественные критерии, быть объективным, и необходима систематизация обонятельных тестов. Для объективной оценки обонятельного восприятия пользуются регистрацией ЭЭГ от большого числа точек, регистрацию ЭОГ в ответ на действие стимула.

В работе Ache B.W. and Young J.M. (2005) рассматривается вопрос, связанный с природой одорантов. Запаховые сигналы служат для коммуникации в различных условиях окружающей среды. Запахи, происходящие от других видов организмов, известные как аллелохимики, контролируют место нахождения добычи, дома, симбиотические связи, метаморфоз и рост. Запахи конспецифической природы, известные как феромоны, действуют как половые аттрактанты. Например, распознавание феромонов указывает на идентичность особи, социальный статус, социальную группу и положение; скопление феромонов опосредует питание, секс и агрессию; дисперсия феромонов сохраняет индивидуальное расстояние (spacing) и минимизирует predation (хищный образ жизни). Репродуктивные феромоны запускают проявление (демонстрацию) ухаживания и позы. Кроме этих триггирующих функций феромоны также служат для “priming” функций, при которых стимул дополнительно или поочередно инициирует длительные изменения у реципиентного животного, не вызывая их немедленных явных ответов. В реальных условиях запахи являются сложными смесями веществ, причем разные смеси могут составляться из одинаковых компонентов, но в разных пропорциях. Одиночные химические вещества могут вызывать физиологические и поведенческие реакции, но полная биологическая активность часто требует стимуляции посредством сложных, мультикомпонентных смесей химичесикх веществ. Даже феромоны насекомых, которые, как считают, являются прототипичными “silver bullet” (серебряными пулями) одорантами, в качестве одиночных веществ могут притягивать самцов мотыльков к самкам, оказыается, являются смесями. Например, мотыльки cabbage looter летают против ветра в ответ на большинство компонентов естественной смеси феромонов, но чтобы вызвать полную поведенческую реакцию у самцов феромоновая железа самки должна выделить еще 6 дополнительных компонентов. Часто именно трудноуловимая разница в соотношениях феромонов насекомого в смеси сохраняет sympatric виды изолированными.

Ссылаясь на работы других, авторы статьи пишут, что все большие животные по опыту определяют турбулентный поток воздуха или воды, где локальные токи и вихри вызывают пертурбацию тучи стимулов, происходящих из точечных источников, приводя в результате высоко прерывистым струйкам запаха. В результате на ольфакторные рецепторные органы стимул действует только прерывисто, когда животное передвигается в среде или среда движется вокруг животного. Специфические параметры структуры струи зависят от среды и, вероятно, вносят вклад в обработку динамических аспектов ольфакторной чувствительности у различных животных.

Гетерогенность проявилась и при исследовании изменений двигательной активности обонятельных жгутиков.

Наблюдая за характером их двигательной активности, мы убедились, что в покое, без воздействия пахучих веществ, они совершают спонтанные движения. Дистальный конец жгутика лишен тубулярного цитоскелета, а, следовательно, молекулярных механизмов подвижности (Бронштейн, 1977; Menco, Farbman, 1984; Matsuzaki et al., 1999). Активные процессы в проксимальном отделе обеспечивают сложную траекторию пассивного движения дистальных зон жгутиков обонятельных клеток (Бронштейн, 1977). Это означает, что основная роль в обеспечении спонтанной двигательной активности принадлежит микротрубочкам цилиарного аппарата в проксимальной части жгутика.

Таким образом, в отсутствии одорантов характер двигательной активности ОЖ сложный и нерегулярный. ОЖ совершают хаотические движения. Такой характер двигательной акивности был выявлен и в работe Трущенкова В.Г., в которой он использовал сложный математический анализ хаотичных процессов (1995). Вместе с тем хаотический режим двигательной активности вне действия одорантов определяет состояние готовности и позволяет легко переходить к определенному динамическому режиму, соответствующему реакции на предъявляемый сигнал (Scarda C.A., Freeman W.J. How brain make chaos in order to make sense of word//Behav. and Brain Sci.-1987, V. 10, P. 161 - 195).

Мы предположили участие в изменениях жгутиковых движений под действием одорантов актинового компонента цитоскелета, который обнаруживается во всех клетках, включая простейшие, но не описан в составе обонятельных клеток. Для проверки этого предположения мы под непрерывным визуальным контролем в течение 40 минут обрабатывали обонятельную выстилку цитохалазином, препятствующим полимеризации F-актина. На рис. , в примембранном слое обонятельных жгутиков видны скопления глыбок разрушенного F-актина, выявляемого с помощью родоминфоллоидина - флуоресцентной метки на его полимеризованное состояние. Однако спонтанные движения обонятельных жгутиков при этом не изменялись. Следовательно, актиновая составляющая их цитоскелета не вовлекается в неупорядоченную двигательную активность при отсутствии пахучего стимула.

В ходе исследований влияния одорантов на характер движений жгутикового аппарата в наших опытах было обнаружено, что стимуляция обонятельной выстилки амиловым спиртом, камфорой, цинеолом, амилацетатом, ванилином и аммиаком ускоряла движения. При этом направленно и активно начинали двигаться дистальные участки обонятельных жгутиков. Появление у них способности к самостоятельной подвижности может быть обеспечено организацией здесь цитоскелета, подобно тому, как это происходит при образовании псевдоподий в градиенте концентрации хемоаттрактантов у одноклеточных организмов и лейкоцитов.

Для выяснения этого предположения мы сначала обонятельную выстилку стимулировали одним из одорантов, а затем обрабатывали родаминфаллоидином. Флуоресценция выявлялась в примембранной области и простиралась по всей длине обонятельных жгутиков, включая и весь дистальный отдел (рис. 69). Это, вероятно, означает, что при стимуляции пахучим агентом обонятельных клеток в них формируется актиновый цитоскелет, обеспечивающий жгутикам, при наличии миозиноподобных белков, выявленных в них А.А. Бронштейном (1966, 1977), активные движения, которые, очевидно, направлены на активный поиск одорантов в обонятельной слизи.

Механизмы реорганизации цитоскелета в обонятельных жгутиках неизвестны. О них можно высказывать только предположения, основанные на аналогии с взаимодействием хемоаттрактантов с одноклеточными организмами и лейкоцитами. В них, как и в обонятельных клетках, стимуляция химическими веществами запускает цепь внутриклеточных реакций с участием посредников. Они инициируют перестройку цитоскелета, обеспечивающую направленное движение одноклеточных организмов и лейкоцитов.

Показано (Bokoch, 2003), что для детекции хемоаттрактантов используются сигнальные пути, сопряженные с G-белком, причем основная роль принадлежит его бета-гамма-субъединице. Стимуляция G-белка обеспечивается взаимодействием лиганда с мембранным рецептором, 7 раз пронизывающим мембрану. В результате этого быстро и кратковременно увеличивается вход кальция, повышается содержание IP₃, цАМФ, цГМФ. Такой же механизм присущ и обонятельным клеткам в процессе обонятельной трансдукции.

У амеб и лейкоцитов следствием их стимуляции является как фосфорилирование миозинов I и II, так и индуцирование хемоаттрактантами полимеризации F-актина. Важно отметить, что процессы, связанные с реорганизацией цитоскелета, локализуются в определенной области. Рецепторы, G-белки, актин-связывающие белки филоподин (гомолог талина), кофилин, коронин и протеин, ассоциированный с аденилатциклазой, аккумулируются на ведущем конце клеток. Ремоделирование актинового цитоскелета может опосредоваться активацией Rho-семейства малых GTPаз (Parent, Devreotes, 1999). Благодаря им осуществляется ассоциация цитоскелета с мембранами на ведущем конце клетки.

Роль кофилина в регуляции нейтрофинами подвижности нейронального конуса роста исследовалась в работе Gehler et al. (2004). В работе изучались сигнальные пути, вовлекаемые в трансдукцию BDNF-индуцируемого (brain-derived neurotrophic factor) увеличения динамики филоподий и их числа через Rho киназа-зависимый механизм. Кроме того, для трансдукции эффектов BDNF необходима и достаточна активность актиндеполимеризующего фактора (ADF)/кофилина. В работе показано, что BDNF повышает активацию ADF/кофилина посредством снижения фосфорилирования ADF/кофилина. Показно также, что BDNF сигнализация не зависит от активности миозина II, которая также может участвовать в процессах вытягивания филоподий. В результате авторы предположили, что вытягивание филоподий регулируется двумя независимыми механизмами. BDNF-зависимый путь, который работает через регуляцию ADF/кофилина независимо от активности миозина II.

В данной работе говорится о том, что нейрональные конусы роста встречаются с внешними сигналами и проделывают выбор пути, который необходим для правильного проведения синаптических контактов. Это выбор опосредуется динамическими сенсорными структурами, ламмелоподями и филоподиями. Филоподии особенно важны при детектировании сигналов направления (guidance) (Gomes, Letourneau, 1994; Kuhn et el., 1994; Dicson, 2002). Сигнализация с помощью направляющих сигналов может начинаться внутри филоподий (Davenport et al., 1993; Robles et al., 2003), и достаточен контакт с одной филоподией, чтобы повернуть (to turn) конус роста (). Наличие филоподий важно, так как без них конусы роста имеют слабую направленность. Кроме того, дендритические и аксональные филоподии участвуют в морфогенезе терминалей и синаптогенезе (). Таким образом, для направления аксона и синаптогенеза важна динамика филоподий. Подвижность конуса роста и направление регулируют нейтрофины (). Они связываются с рецепторами двух типов, селективными Trk рецепторными тиразинкиназами и рецептором к p75 pan-нйтрофину. Индукция поворота конуса роста с помощью нейтрофинов вовлекает Trk-зависимый механизм (), тогда как динамику филоподий нейтрофины регулируют через р75-зависимый механизм ().

Динамика филоподий вовлекает сложную регуляцию актиновых филаментов. Выпячивание филоподии и ламеллоподии вовлекает уравновешивание между полимеризацей актина, ретроградным потоком филаментов и деполимеризацией актина (Mallavarapu, Mitchison, 1999). Эти процессы являются мишенью Rho GTPаз (Dickson, 2001). Rho-киназа (ROCK) является эффектором RhoA, которая регулирует динамику актина несколькими путями. ROCK активирует LIM-киназу (LIMK), которая фосфорилирует актиндеполимеризующий фактор ADF/кофидин, ингибирующий ее активность (). ADF и кофилин принадлежат консервативному семейству актин-ассоциированных протеинов, которые увеличивают динамику актина (Bamburg, 1999). ADF/кофилин связываются с актиновыми филаментами, стабилизируя скрученную форму филамента (Me Gough et al., 1997; Galkin et al., 2001). В результате увеличивается процент off (выключенных) актиновых филаментов и разделяющихся филаментов ().

Роль кофилина в регуляции нейтрофинами подвижности нейронального конуса роста в тканевой культуре сетчатки 7-дневного эмбриона цыпленка исследовалась в работе Gehler et al. (2004). В работе изучались сигнальные пути, вовлекаемые в трансдукцию BDNF-индуцируемого (brain-derived neurotrophic factor) увеличения динамики (изменения длины) филоподий и их числа через Rho киназа-зависимый механизм. Филоподии – динамичные клеточные вытягивания, играющие ключевую роль в морфогенезе (). В нейрональных конусах роста они выполняют сенсорную функцию, совершая прощупывание в градиенте хемоаттрактантов. (Реакция, сходная с поведением ОЖ при их стимуляции). Покзано (), что поворачивание конуса роста в сторону хемоаттрактанта инициируется асимметричным распределением филоподий (). Сигнальные системы филоподий могут инициировать реакции конуса роста на внеклеточные лиганды ().

Итак, под действием нейтрофинов увеличивается не только число, но и длина филоподий. 30% увеличение длины филоподий (Если ОЖ вытягиваются, то, наверное, в пространстве их длина тоже увеличивается) расширяет объем поиска конуса роста на 120%. Такое увеличение сенсорной способности может облегчать (способствовать) обнаружение морфогенетических градиентов (). Следовательно, более длинные филоподии могут увеличивать способность конусов роста обнаруживать направляющую (guidance) или морфогенетическую информацию на клетках и во внеклеточном пространстве.

Помимо сигнализации через LIMK ROCK может регулировать подвижность конуса роста также посредством регуляции активности миозина II (Amano et al., 1996; Kimura et al., 1996).

Помимо реорганизации актинового цитоскелета, под действием хемоаттрактантов изменяется и миозиновый. В этом процессе участвует цГМФ, который способствует транслокации тяжелой цепи миозина II к клеточному кортексу (Paren, Devreotes, 1999).

Непосредственную модуляцию динамики актинового цитоскелета осуществляет и фосфоинозитол 4,5-бифосфат (PI4,4P2), который играет ключевую роль в регуляции полимеризации актина на мембранном сайте. Он cинтезируется под действием фосфатидилинозитолфосфаткиназы, выполняющей доминирующую регуляторную функцию актинового цитоскелета. Свою регуляторную функцию этот фосфоинозитид осуществляет посредством локального изменения своего синтеза на плазмолемме. Он рекрутирует актин-связывающие протеины к определенным субклеточным областям и изменяет активность и динамику актина посредством модуляции путей сигнальной трансдукции и активности актинсвязывающих протеинов, Rho, Rac и Arf (Doughmann et al., 2003; Yin, Janmey, 2003).

Solzin J. et al. (2004). Хемотаксис сперматозоидов – важный шаг к оплодотворению. Сперматозоиды хранятся в гонадах в неподвижном состоянии, но становятся подвижными за секунды после метания икры в морскую воду. Икринки привлекают спрематозоидов высвобождением пептидов (). Градиент концентрации пептида обеспечивает сигнал, который приводит к аккумуляции сперматозоидов около икринок. Этот процесс требует входящего тока Са из внеклеточной среды. В ходе хемотаксиса сперматозоид изменяет свое плавательное поведение в градиенте хемоаттрактанта, который выделяется яйцеклетками, и, в конце концов, сперматозоиды концентрируются возле яйцеклетки. Широко испльзуемой моделью для изучения хемотаксиса является морской еж Arbacia punctulata. Resact – хемоаттрактант этого ежа – пептид, который связывается с рецепторной гуанилатциклазой (РГЦ). Стимуляция сперматозоида этим хемоаттрактантом вызывает повышение внутриклеточного рН и входящий поток Са, причем вход Са необходим для хемотаксического поведения. Авторы показали, что при физиологических концентрациях (менее 25 рМ) resact повышение Са предшествует повышению рН в клетке, что означает, что resact-индуцируемая реакция рН не является обязательным этапом в сигнализации при хемотаксисе сперматозоида.

Обзор Kaupp U.B. et al. (2008). В нем рассматривается механизм хемотаксиса в сперматозоидах. В нем рассматриваются различия и сходство в сенсорной сигнализации в сперматозоидах, фоторецепторах и обонятельных клетках.

Яйцеклетки привлекают сперматозоиды высвобждением химических факторов. Сигналы, которые направляют (guide) sperm к яйцеклетке (процесс, который называется хемотаксисом), обеспечиваются градиентом хемоаттрактанта. При этом теперь стало ясно, что хемоаттрактантная сигнализация у морских беспозвоночных и млекопитающих может радиакльно отличаться.

Хемотаксис у морских беспозвоночных

В 1980-х г.г. Garbers et al. (3 - 5) идентифицировали короткие пептиды в оболочке яйцеклетки и ГЦ рецепторного типа в сперматозоиде как пептидный рецептор. В это время Vacquier et al. (6) показали, что resact, белок A. puctulata (морской еж) проявляет хемотактическую активность, и что для хекмотаксиса необходимы ионы Са. Brokaw and coll. (7, 8) показали, что форма волны флагеллы sperm, чью мембрану обрабатывали детергентами для получения проницаемой мембраны, зависит от концентрации Са в среде: при низкой концентрации Са флагелла бьется более симметрично, тогда как при высокой концентрации – форма волны становится более асмметричной. Показано (9 - 12), что траектория плавания sperm различных морских беспозвоночных в градиенте хемоаттрактантов характеризуется изменением плотных петель и широких круговых изгибов (arcs - дуг). Широкие круговые изгибы совершаются в направлении источника, тогда как плотные петли sperm совершает при плавании от источника.

Хемоаттрактанты вызывают множество других клеточных реакций, включая изменение уровней циклических нуклеотидов, внутриклеточного рН, паттерна фосфорилирования протеинов и мембранного потенциала. Сложные модели клеточной сигнализации, которые предложены, связывают эти события с изменениями концентрации внутриклточного кальция и плавательным повдением (13 - 18). В настоящее время эти модели доказаны с помощью кинетических методик, способных проследить последовательность сигнальных событий и получающееся навигационное движение sperm в химическом градиенте.

Sperm of A. punctulata очень чувствительны: они могут реагировать на связывание одиночной молекулы хемоаттрактанта и преобразовывать это связывание в элеметарный потенциал и Ca-ответ (19, 20).

Сигнальный путь и его молекулы

Сигнализация хемотаксиса лучше всего изучена на sperm A. punctulata (СМ. РИС.1 в обзоре). Resact активирует ГЦ на флагелле и посредством этого стимулирует быстрый синтез 3,5-цГМФ (19). цГМФ открыает К-cng-зависимые каналы, чтобы получить кратковременную гиперполяризацию (20). В ходе гиперполяризации восстанавливаются от инактивации потенциал-зависимые Са-каналы (Са_v), которые открываются при последующей деполяризации, возникающей в результате открытия каналов, активируемых геперполяризацией и зависимых от циклонуклеотидов (HCN-каналы) (21). Последующая динамика кальция контролирует флагеллярное биение и регулирует траекторию плавания sperm в градиенте хемоаттрактанта (22) (СМ. РИС. 1 и 2 в обзоре).

Рецептор

Рецептор к хемоаттрактанту принадлежит семейству рецепторных ГЦ (29). Фактически именно ген ГЦ был впервые клонирован из A. punctulatum. Семейство рецепторов этого типа характеризуется единственным трансмембранным доменом, который делит молекулу на внеклеточный домен (ECD) для связывания с лигандом и внутриклеточную область, содержащую домен, гомологичный киназе, шарнирную (hing) область (Н) и домен, гомологичный циклазе, который несет каталитический сайт.

ГЦ высоко фосфорилирована в покое и дефосфорилируется при связывании с resact (30, 31). Энизматическая активность дефосфорилированной формы ниже, чем фосфорилированной. Это означает, что рецептор инактивируется при дефосфорилировании (32). В области молекулы ГЦ, гомологичной киназе, из 6 фосфорилированных остатков идентифцировали 5 ser-остатков. У млекопитающих в этом домене в изоформах ГЦ-А и ГЦ-В имеется 5 и 6 фосфорилированных остатков, соответственно (33, 34). 4 из 6 фософорилированных остатков дефософрилируются при стимуляции resact. Показано, что в интактном sperm скорости инактивации и дефософорилирования ГЦ сходны. Это означает, что время жизни активированного рецептора (около 300 мс) контролируется дефосфорилированием. Хемотаксис sperm зависит от точного timing Са-транзиентов, которые контролируют траекторию плавания. Последовательность этапов фосфорилирования-дефосфорилирования может также жестко контролировать время жизни активной ГЦ и посредством этого генерировать однородные (единообразные) реакции на одиночные молекулы (как в фоторецепторах на одиночный фотон). Этот механизм повышает точность, с которой кодируется timing и число событий связывания.

Sperm A. punctulata реагируют на фемтомолярные концентрации resact (19). Чрезвычайная чувствительность требует высокой эффективности захвата, то есть высокой плотности рецепторов к хемоаттрактантам, наделенных высоким сродством. В настоящее время насчитывают около 1000000 молекул ГЦ на флагеллу или около 30000 молекул ГЦ на 1 мкм². Каждая молекула ГЦ связывается с одиночной молекулой resact. Таким образом, sprem морского ежа обладает высокой плотностью рецепторов, чтобы максимизировать вероятность связывания хемоаттрактанта с флагеллой.

Регулирование сродства связывания. Sperm может взаимодействовать с хемоаттрактантом от фемтомолярных до микромолярных концентраций без достижения насыщения. Расчеты коэффициента Хилла показали, что связывание рецептора с лигандом контролируется отрицательной кооперативностью и что по крайней мере 3 молекулы лиганда могут связываться с рецептором. Отрицательная кооперативность требует, чтобы с олигомерным комплексом взаимодействовало несколько субъединиц ГЦ. Фактически ГЦ во флагелярной мембране существует в виде гомотримера, что совпадает с предположением, что, по крайней мере, 3 субъединицы участвуют в аллостерическом взаимодействии. Однако в регулирование сродства связывания могут вносить вклад и другие механизмв. Из-за высокого сродства и плотности связывания, при концентрациях resact от пикомолярных до наномолярных, связывание далеко от химического равновесия, то есть sprem register относительные изменения, а не абсолютные значения концентраций. Таким образом, sperm спасается от насыщения даже при высоком сродстве связывания.

Механизмы усиления сигнала. Усиление начального сигнала детерминируется числом молекул цГМФ, синтезируемых в секунду активной молекулой ГЦ. На интактных sprem показано, что для того, чтобы обеспечить быструю реакцию на стимуляцию одиночной молекулы лиганда, в пределах менее 100 мс стойко синтезируется цГМФ со скоростью около 5 молекул цГМФ в сек, что точно согласуется со скоростью, обнаруженной для других активных ГЦ рецепторного типа (40).

К-селективный cng-канал.

Красители для регистрации потенциала на мембране. Электрическую активность sperm исследовали с помощью карбоцианиновых и oxonal красителей, имеющих высокую чувствительность к изменению потенциала на мембране (27, 41 – 43). Однако у этих красителей есть ряд недостатков, в частности, они инерционны и распределяются также в мембранах внутриклеточных органелл, чувствительны к изменению рН, изменяют потенциал покоя и связываются с внутриклеточными компонентами. Поэтому в последнее время для флуоресцентного анализа электрической активности клеток применяют Di-8-ANNEPS, который не имеет этих недостатков. При коротком времени инкубации этот краситель окрашивает наружный слой плазматической мембраны и не достигает внутриклеточных органелл. Кроме того, он реагирует на изменение потенциала менее, чем за 1 мс. Наконец, электрохимический механизм чувствительности к потенциалу позволяет измерять дву-эмиссионное отношение, которое исключает большинство флуороесцентных сигналов, связанных с потенциалом. Показано, что значение мембранного потенциала в sperm около минус 45мВ. Это значительно меньше, чем потенциал Нернста для ионов К. Это означает, что в его поддержании принимает участие несколько ионных каналов с разлиной селективностью (20, 42).

Структура KCNG-канал. И лиганд и цГМФ вызывают кратковременный гиперполяризующий импульс, за которым следует более стойкая деполяризация. Гиперполяризация вызывается открытием KCNG-каналов (20). KCNG-канал клонирован у A.punctulata и A.purpuratus, и их функция охарактеризована в гетерологической системе экспрессии. Эти каналы проявляют уникальную мембранную топографию. Он состоит из 4 гомологичных поворотов в одиночном большом полипептиде с общей Мм около 250 кДа. Каждый поворот имеет 6 трансмембранных сегментов, S1 – S6, область шпильковой (harpin) поры между S5 и S6, циклонуклеотид-связывающий домен (CNBD) и линкерную (связывающую) область между S6 и CNBD. Общая структура KCNG-канала больше похожа на структуру потенциалзависимых Са- и Na-каналов, которые образуют псевдотетрамерный канал из одиночного большого полипептида, чем на циклонуклеотид-регулируемые каналы, которые образуют гетеротетромер из 4-х более мелких субъединиц. Все 4 области поры несут GYGD ключевую последовательность К-селективных каналов (46). В CNBD-области характеристики аминокислотных остатков цАМФ- и цГМФ-связывающих доменов сохранились от CNG- и HCN-каналов.

KCNG-канал проявляет исключительную чувствительность и селективность к цГМФ. В гетерологической системе эеспрессии KCNG-канал активируется наномолярными концентрациями цГМФ (К_1/2 около 5нМ) по некооперативному пути. цАМФ действует как парциальный агонист при приблизительно в 1000 раз большей концентрации. Благодаря высокой чувствительности к цГМФ KCNG-канал открывается при стимуляции sperm, когда синтезируется всего несколько молекул цГМФ.

HCN-каналы.

Во флагеле sperm морского ежа идентифицированы 2 канальные изоформы, принадлежащие семейству HCN-каналов (21, 47). Эти каналы активируются при гиперполяризации мембраны (когда мембранный потенциал становится отрицательным более чем на -4 мВ), и их вероятность открытого состояния при данном потенциале увеличивается с участием цАМФ (48 - 50). Хотя их относительная проницаемость для К в 3 – 4 раза больше, чем для Na при физиологических условиях (высокая концентрация Na_e и высокая концентрация К_i), эти каналы обеспечивают деполяризующий входящий ток, создаваемый ионами Na. Эти каналы в sperm морских ежей выполняют много различных функций. Однако они отличаются от млекопитающих.

Каналы входа Са.

Под действием resact в одиночных sperm регистрируются 2 компоненты Са-сигнала: ранняя и поздняя кинетические фазы. Поздняя фаза проявляется при концентрации лиганда 1 нМ и держется в течение 2 минут. Как лиганд, так и цГМФ вызывают череду Са-спайков во флагелле.

Са-каналы открываются под действием гиперполяризации (20). Таким образом, при потенциале покоя в sperm около -45 мВ потенциал-зависимые Са-каналы инактивированы. В ходе гиперполяризации эти каналы сначала восстанавливаются от инактивации, а затем открываются. Этот механизм восстановления от инактивации имеет 2 важные ветви. В режиме одиночной молекулы локально генерируемая гиперполяризация пассивно распространяется и влияет на все потенциалзависимые Са-каналы вдоль флагеллы. Вследствие этого информация на сайте связывания с лигандом теряется, что свидетельствует в пользу временного, а не пространственного механизма восприятия градиента. Кроме того, этот механизм может обеспечить вторую стадию усиления, которую необходимо учитывать, когда оцентивается полное усиление сигнала.

Сперматозоиды, фоторецепторы и обонятельные сенсорные клетки (СМ. РИС.3 в обзоре).

Механизм сигнальной трансдукции в sperm и фоторецепторах сходен. Оба проявляют высокую чувствительность рецептора к стимулу (одна молекула и один фотон, соответственно). Взаимодействие с рецептором кратковременно, поэтому время жизни рецептора контролируется процессами фосфорилирования в sperm и дефосфорилирования в фоторецепторах промежуточных звеньев (интермедиатов). В палочках, а, возможно, и в sperm последующие шаги инактивации контролируют время жизни рецептора и посредством этого продуцируют единообразые элементарные реакции (). И sperm и палочки реагируют начальной гиперполяризацией в 1 – 2 мВ. В sperm открытие KCNG-каналов приводит к гиперполяризации. В палочках неселективные CNG-каналы, которые открыты в темноте, закрываются при стимуляции светом. Начальное усиление сигнала приблизительно в 1000 раз слабее в sperm, чем в палочках. В палочках одиночный фотон стимулирует гидролиз около 10000 молекул цГМФ (55), однако из-за относительно высокой концентрации свободного цГМФ (около 2μМ) фракционное изменение маленькое. Наоборот, в sperm одиночная молекула хемоаттрактанта стимулирует синтез около 5 молекул цГМФ. Хотя концентрация свободной цГМФ во флагелле неизвестна, она должна быть в нижней наномолярной области, чтобы поддерживать неболшую фракцию открытых KCNG-каналов. Во флагелле (объем менее или равен 1,6 fl) одна молекула цГМФ равна концентрации в 1 нМ. Таким образом, увеличения [цГМФ в клетке] на несколько наномолей достаточно, чтобы открыть небольшую фракцию KCNG-каналов.

Функциональные параллели между sperm и обонятельными клетками. Связывание с одорантами активирует цАМФ-сигнальный путь в обонятельных клетках. В них АЦ или ГЦ синтезируют цАМФ с низкой скоростью, однако это не мешает проявлению высокой чувствительности. Генерация электрических реакций и в sperm и в ОК вовлекает 2 типа ионных каналов (СМ. РИС. 3 в обзоре). В ОК начальный вход Са через CNG-каналы открывает Са-зависимые Cl-каналы, посредством чего усиливается реакция деполяризации (57).

Плавательное поведение

Ca-сигнал и моторная реакция. У sperm длина флагеллы достигает около 50мкм. Биение волн, которые продвигают клетку вперед, продуцируется моторными протеинами, находящимися в аксонеме. В трехмерном пространстве sprem морского ежа плавают по спиральной траектории в виде колец (СМ. РИС. в этом обзоре). ().

Согласно гидродинамической модели, которая объясняет целесообразность такого специфического поведения, ключевой частью ее является короткий проксимальный сегмент, который детерминирует положение головки относительно направления и плоскости биения флагеллы. Изгиб (кривизна) этого сегмента принят за параметр сгибания (изгибания). При анализе поведения на стеклянной поверхности, покрытой водой, когда головка перемещается из плоскости биения так, что продуцируется chiral форма, sperm плавает по спиральной траектории. Когда sperm приближается к поверхности, сочетание chiral формы, переднего колющего удара (forward thrust) и гидродинамического отталктвания между флагеллой и поверхностью приводит в результате к круговым траекториям. Параметр сгибания детерминирует курватуру траектории плавания. Таким образом, управление направлением движения sperm можно рассматривать как модуляцию параметра биения, но могут вносить вклад и другие изменения симметрии в форме волны флагеллы.

Исследовали реакцию мотора в аксонеме в отсутствии градиента хемоаттрактанта. Для этого наблюдали за изменением характера движения флагеллы в подвижном sperm после быстрого высвобождения цГМФ из введенной в клетку связанной его формы посредством короткой вспышки УФ-света (). Оказалось, что при такой стимуляции меняется форма волны флагеллярного биения, и sperm меняет траекторию своего движения: он выходит из кругового характера плавания. Новая траектория характеризуется переменными периодами более высокой кривизны (изгибы – turn или сгибы - bends) и более низкой кривизны (бег - run), что приводит в результате к петлеобразной траектории. Через некоторое время sperm возобновляет свою траекторию кругового плавания. Показано, что флуктуации кривизны триггируются Са-спайками во флагелле (см. Рис. 2d). Такие же флуктуации Са вызывают и специфичексие лиганды: resact у A.punctulata и speract у A. purpuratus ().

Траектория плавания тесно связана с изменением формы волны флагеллярного биения. Асимметричная форма волны вызывает turns и bends в траетории, тогда как более симметричное биение приводит к более прямой траектории плавания.

Преложена turn-and-ran модель для описания моторной реакции (22) (СМ. РИС.2f в этом обзоре) – СРАВНИТЬ С ПОВЕДЕНИЕМ ОЖ ПРИ СТИМУЛЯЦИИ.

Согласно ей, sprem непрерывно замеряет (sample) концентрационное поле (field). Время замера (sampling), необходимое для того, чтобы вызвать реакцию, может совпадать со временем инактивации ГЦ. За замером следует период приостановки (delay - задержки). Время приостановки для Са-ответа объясняется скоростью гиперполяризации и временем, необходимым для восстановления Са _v –каналов от инактивации (20). Наконец, sperm поворачивается (turn), когда [Ca] в клетке начинает повышаться; за этим оборотом следует период бега (run) вверх градиента. Приостановка моторной реакции несколько длиннее, чем задержка Са-реакции (), возможно, из-за того, что требуется время для достижения пороговой концентрации Са и преобразования повышенной [Са] в активность моторных протеинов.

Navigation strategy

Плавание sperm в градиенте концентрации хемоаттрактанта (СМ. РИС.2а в обзоре). В этих условиях sperm плавает по траекториям, характеризующимся повторными петлями (12). Каждая петля состоит из сегментов turn и run. Полную траекорию можно рассматривать как вереницу turn-and-run эпизодов. Turns могут быть плотные (tight), a runs длинными; в свою очередь, разница в кривизне между turn и run может быть маленькой, что обусловливает паттерн дрейфующего кольца. Траектория центра дрейфующего кольца может быть линейной или искривленной (). В градиенте периодические изменения в концентрации хемоаттрактанта и флуктуаций Са синхронизируются с фазовым сдвигом около 150º (РИС.2е). Это означает, что периодическая стимуляция благодаря круговому плаванию, преобразуется в периодическую модуляцию формы волны флагеллы и посредством этого в модуляцию также и кривизны траектории. Круги имеют около 50 – 60 мкм в диаметре. При средней скорости около 200 мкм в секунду sperm выигрывет около 1 с, чтобы завершить 1 поворот. Так как частота Са-спайков приблизительно соответствует угловой частоте циркулярного плавания, на один поворот гнерирутся одиночный Са-спайк.

Разработано теоретическое описание хемотаксиса sperm (64). Во время плавания по круговой траектории в градиенте концентрации sperm сталкивается с периодической стимуляцией хемоаттрактантом. Сигнальный путь преобразует стимул в периодическую модуляцию кривизны траектории. Здесь существует характерный фазовый сдвиг между периодической стимуляцией и периодической модуляцией кривизны траектории, который зависит от движущих сил (dynamics) сигнальной системы. Фаза сдвига определяет направление дрейфующих круговых траекторий.

Характеристика упорядоченного движения sperm в градиенте концентрации стимула (СРАВНИТЬ С ДВИЖЕНИЕМ ОЖ). Описанная выше модель точно повторяет характерные свойства плавательного поведения sperm. Например, траектории дрейфующих кругов могут быть прямыми, изогнутыми или спиралевидными, в зависимости от фазы сдвига. В 3-х мерном изображении траектория плавания является наклонной спиралью, чья ось выстраивается в линию (align with) с градиентом. Это механизм, основанный на идее спирального клинотаксиса (helical klinotaxis) (58, 65 - 67). Механизм поведения sperm сходен у разных представителей беспозвоночных.

Поведение sperm у млекопитающих.

Полагают, что хемотаксис sperm у млекопитающих более сложный, чем морских беспозвоночных. В этом поцессе участвует не один хемоаттрактант, а также играет роль термотаксис (83).

Одоранты (обонятельные рецепторы в ОЭ и в sperm).

Обонятельные рецепторы экспрессируются эктопически в ряде тканей, помимо ОЭ (87). Транскрипты обонятельных рецепторов идентифицированы в male germ cells (мужские эмбриональные клетки) () и в sperm cобаки (89). Их обнаруживают в testis и sperm (90 - 94). Идентифицирован рецептор hOR17-4 (OR1D2) как в ОЭ, так и в sperm (97, 98). Цветочны запах – bourgeonal (бурженал – запах ландыша)– действует как агонист для этого рецептора, а поведенческий анализ показал, что он является хемоаттрактантом. Bourgeonal (бурженал) стимулирует Са-ответы в sperm человека. Ингибирование трансмембранной АЦ блокировало и Са-ответ и хемотаттрактивные реакции. Масс-спектрометрия и иммуногистохимия привели к идентификации различных изоформ АЦ (99-101). Показано, что у мышей mOR23 экспрессируется в round spermatids (102). Lyral, другой цветочный запах, является лигандом для mOR23, и стимуляция этим одорантом вызывает увеличение [Ca] в epididymal sperm. Поведенческие эксперименты показали, что sperm мыши совершает Са-опосредованный хемотаксис в градиенте концентрации lyral. Похоже, что два этих одоранта действуют видоспецифически. Предлагается следующая схема хемотаксиса в sperm млекопитающих:

Лиганды → ОR→ Golf → tmАЦ → цАМФ→ [Ca] → реакция моторов → хемотаксис.

Однако, эту схему следует еще проверять. Здесь есть некоторые противоречия, касающиеся компонентов этого цАМФ-сигнального пути.

CHANG Y, SUAREZ S S Rethinking trh relaionship between hyperactivation and chemotaxis in mammalian sperm // Biology of reproduction, 2010? 83: 507 – 513.

Резюме. Гиперактивация, паттерн подвижности сперматозоида в фаллопиевых трубах млекопитающих, важна для оплодотворения. Гиперактивация попмогает сперматозоиду эффективно проплывать по слизи этих труб, вырываться из резервуара сперматозоидов и проникать через cumulus matrix и зону pellucida у ооцита. Существуют некоторые доказательства, сперматозоид млекопитающих может подвергаться хемотаксису. Однако связь хемотаксиса с гиперактивностью неизвестна. В гиперактивакцию, а также в хмотаксис вовлекается Са-сигнализация. In vivo сперматозоид гиперактивируется в более низких слоях фаллопиевых труб, на расстоянии от cumulus-oocyte комплекса и, вероятно, в далеке от влитяния хемотаксических градиентов, исходящих от ооцитов или cumulus. Таким образом, сперматозоиды, вероятно, гиперактивируются до ощущения хемотаксических градиентов. Хемотаксические сигналы, возможно, модулируют гиперактивацию, чтобы напрлять сперматозоиды к ооцитам, где они достигают области воздействия. Са-регулируемая модуляция гиперактивации является возможным механизмом этого процесса.

Введение.

У млекопитающих, хотя самцы откладывают тысячи или даже миллионы сперматозоидов в репродуктивном тракте самок, только такое огромное количество не гарантирует оплодотворения. Удачный транспорт сперматозоида, проникновение в яйцеклетку и слияние сперматозоида и яйцеклетки зависят от способности сперматозоида реагировать репродуктивное окружение самки и способности самки влиять на развитие (прогресс) и физиологическое состяние сперматозоидов.

В 1970 Yanagimachi наблюдал, что сперматозоид хомячка, плавающий в яйцеводе, проявлял очень энергичный паттерн подвижности с высоко амплитудным асимметричным флагеллярным биением (1), который позднее он определил как гиперактивность. Это первое наблюдение открыло дверь в новую область исследоания. С тех пор получено много знаний о паттерне подвижности сперматозоида у различных видов млекопитающих.

Хемотаксис в этой статье определяется как процесс, с помощью которого сперматозоид управляется (направляется) химическим градиентом, чтобы достичь ооцита. Хемотаксическое поведение и лежащие в основе молекулярные механизмы показаны у некоторых видов морских беспозвоночных с внешним оплодотворением (Каупп и др.) (2). Наоборот, существование хемотаксиса при оплодотворении у млекопитающих пока обсуждается. Хотя доказательство хемотаксиса у сперматозоида млекопитающих появилось уже в 1958 г. (3,4), интенсивные исследования на субъектах начались только в 1990-х годах. В это время отметили, что сперматозоиды человека хемотасически привлекаются фоликуллярной жидкостью (5 – 7), которая, как считали, транспортируется в яйцевод вместе с oocyte/cumulus комплексом. Затем были опубликованы доказательства для хемотаксиса у других видов млекопитающих ().

Гиперактивация и хемотаксис уже исследованы многими группами исследователей, однако связь между этими двумя фноменами пока неясна. В этой статье предлагается модль такой связи.

Сопоставление определений гиперактивации и хемотаксиса

Гиперактивация характеризуется высокоамплитудными, асимметричными флагеллярными биениями. Если гиперактивированный сперматозоид поместить в водной среде на микроскопический слайд, он будет плавать по кругу или по спиральной (геликоидальной) траектории из-за асимметричного биения. До гиперактивации плаватльная тректория сперматозоида относительно прямая из-за низко амплитудного, почти симметричного биения. Такое поведение рассматривается как активированная или поступательная (прогрессивная) подвижность. До эякуляции в зрелом сперматозоиде поддерживается слабое подвижное или неподвижное состояние в каудальном эпидидимисе и vas defertns. Они быстро активируются, когда они выпускаются при эякуляции или при вкрытии в соответсвующую среду, которая обычно должна содержать бикарбонат и ионы Са ().

Если гиператкивацию определяют как паттерн флагеллярного биения, то хемотаксис определяют как паттерн траектории плавания спераматозоида по отношению к химическому градиенту. Они представляют собой два разных типа определений. Т.о., сперматозоид может использовать гиперактивацию, возможно, прерывисто, чтобы актвировать хемотаксис.

Гораздо больше сведений получено о процессе хемотаксиса у сперматозоидов некоторых видов морских беспозвоночных, и эти виды послужили моделью для исследования хемотаксиса. У разных видов морских беспозвоночных, включая морских ежей Arbacia punctulata, реакция сперматозоида на хемотаксический сигнал от яйца вовлекает паттерн “turn-and-run”, в котором траектория плавания колеблется между высокой и низкой кривизной из-за чередования между асимметричным и почти симметричным флагеллярным биением. Это чередование продуцирует свободно (loosely) винтообразынй паттерн , ось которого направлена к источнику аттрактанта (Kaupp et. al). Паттерн “turn-and run” явно не виден у сперматозоида млекопитающих. Фактически подробности флагеллярной реакции сперматозоида млекопитающих на хемоаттрактанты хорошо неизвестны. Наиболее подробным объяснением был рисунок , показывающий сперматозоида человека, реагирующего на градиент буржонал (12). На этом рисунке флагеллярное биение переключается с симметричного на асимметричное только для одного цикла биения, а затем возвращается к симметричному биению. Единственный цикл переключения служит для ориентации сперматозоида в градиенте. Повторные чередования между симметричным и асимметричным биением, котрые видны у сперматозоидов беспозвоночных, не показаны для сперматозоидов млекопитающих. Возможно, что паттерн флагеллярной реакции сперматозоида млекоптающих хорошо неизвестен, из-за того, что прямое наблюдение за паттерном плавания сперматозоида млекопитающих, тестируемого предполагаемыми хемотаксическими агентами, ограничены в большинстве исследований очень низкой скоростью реакции сперматозоида (13). Трудно зафиксировать паттерны флагеллярногобиения нескольких сперматозоидов, которые действительно реагируют.

Противопоставление функций гиперактивации и хемотаксиса.

Гиперактивация играет разную роль при перемещении сперматозоида к ооциту. Во-первых, сперматозоид использует гиперактивацию для перемещения из oviductal storage reservoir. Сперматозоид удерживается в резервуаре путем прикрепления к эпителию яйцевода (14) и гиперактивация способствует сперматозоиду при торможении освободиться от прикрепления (15 – 18). Во-вторых, гиперактивация обеспечивает сперматозоиду большее тяговое усилие для плавания через вязкоэластические субстанции яйцевода (19 – 21), которые включают слизь, секретируемую эпитедием яйцевода, и матрикс oocyte’s cumulus oophores. Наконец, гиперактивация требуется сперматозоиду для проникновения в зону pellucida ооцита, чтобы достич и слиться с плазмолеммой ооцита (22 – 24).

По определению, хемотаксис – это направленное движение сперматозоида к источнику химического градиента, которым обычно считают ооцит. Поскольку все функции, которые до сих пор приписывают гиперактивации, помогают сперматозодиду в достижении ооцита, они делают так только опосредованно. Если мы согласимся с определением гиперактивации как асимметричным флагеллярным биением, маловероятно, что длительная гиперактивация приведет сперматозоид к ооциту, пока паттерн флагеллярного биения не будет периодически модифицируется, как будет описано ниже.