Наиболее широко применяемым методом достижения асептических условий в БТ производстве является стерилизация.

Практическая реализация термической стерилизации зависит от вида стерилизуемого объекта. Пустые аппараты и коммуникации чаще всего стерилизуют насыщенным паром, питательные среды и другие жидкости – нагреванием под давлением.

Термическая стерилизация основана на том, что при высоких температурах погибают как вегетативные клетки, так и споры (покоящиеся зародышевые клетки, которые выдерживают влияние высоких температур, радиации, различных токсических веществ). Гибель микроорганизмов под действием высоких температур происходит в результате коагуляции белков. Важное значение при этом имеет содержание воды в клетке – чем больше воды, тем ниже температура коагуляции белков. Этим объясняется высокий стерилизующий эффект насыщенного пара – он не только нагревает, но и дополнительно увлажняет клетки, что повышает их термочувствительность. Сухой горячий воздух используют для стерилизации материалов и предметов, которые могут быть испорчены при обработке паром (жиры, масла, порошки, предметы, подверженные коррозии и т.д.)

При выборе режимов термической стерилизации жидкостей необходимо учитывать два условия: стерилизация должна обеспечить уничтожение микрофлоры и при этом минимально разрушить полезные вещества. Температура и продолжительность стерилизации зависят от состава среды, ее количества, обсемененности (количество м/о на г или мл).

Периодическую стерилизацию жидкостей применяют для сред в колбах, лабораторных ферментов, сред, не имеющих термолабильных соединений. Недостатки: длительность, неоднородность температурного воздействия на среду в больших объемах, потери лабильных компонентов. Непрерывная стерилизация используется для обработки больших объемов ЖПС.

Режим стерилизации включает 3 периода: нагревание до t_ст, выдерживание при t_ст, охлаждение.

Следует отметить, что различные м/о обладают неравной теплостойкостью, поэтому в качестве исходного параметра в процессе стерилизации обычно принимают высокую начальную концентрацию самого теплостойкого организма. Такая величина составляет 10⁶ клеток в 1 мл (минимальное количество клеток для визуального обнаружения составляет 10⁷кл/1 мл).

Самая стойкая микробная форма – бактериальная спора (аэробные бактерии спорообразующие – Bacillus, анаэробные бактерии спорообразующие – Clostridia).

Относительная стойкость различных форм микроорганизмов во влажном тепле:

вегетативные бактерии и дрожжи – 1,0

бактериальные споры – 3*10⁶

плесневые споры – 2 – 10

вирусы и бактериофаги – 1 – 5

Кинетика гибели под действием тепла

Константа скорости гибели клеток k является функцией t^oC. Ее можно найти из уравнения Аррениуса

k=A*e^-E/RT

А – коэффициент Аррениуса,

Е_а – энергия активации, для спор – 60 – 70 ккал/моль,

R – универсальная газовая постоянная,

Т – температура.

Из зависимости скорости гибели спор от t^o следует, что чем выше t^o, тем короче время стерилизации.

Этот принцип является основополагающим для непрерывной стерилизации среды.

Степень стерилизации зависит от времени и t^o.

При расчетах полагают, что все компоненты среды нагреваются до одной и той же t^o за один и тот же промежуток времени. Такое допущение справедливо, если все компоненты в среде растворимы.

Примеры.

Например:

1. Bac. stearothermophilus NCA 1518 снижает в 10 раз количество жизнеспособных клеток в воде при 115,6 С^o за 7,03 мин, а в молоке при 127 ^оС за 0,13 мин.

2. Так в производстве хлебопекарных дрожжей способ подготовки основного сырья - мелассы к переработке зависит от ее обсемененности. если 1 г ее содержит до 2000 м/о. то она считается пригодной для хранения и после разбавления водой и раскисления, осветляется и идет в производство. Если 2000 – 10000, то требует специальной обработки - антисептики, пастеризация.

3. Если в жидкой среде присутствуют частицы, то τ_стер будет зависеть от их физических свойств – размера и плотности и потребует дополнительное время для их прогрева.

нет частиц – прогрев не требуется

частицы 100 мкм – на τ_{прогрева} + 0,01 с

частицы 1 мм - на τ_{прогрева} + 1 с

частицы 10 мм - на τ_{прогрева} + 100 с

4. время достижения одинаковой степени стерильности среды в аппаратах разного объема

0,20 м³ – 45 мин

5,7 м³ – 52 мин

57 м³ – 64 мин

Для нерастворимых в воде компонентов (целлюлоза, с/х отходы, крахмал и др.) важную роль играет скорость теплопереноса к частицам.

Продолжительность нагревания частиц разного размера до достижения ими 99% конечной t

1 мкм – 1*10^-6 с

10^-5 м – 1*10^-7 с

0,1 мм – 1*1^-5 с

1 мм – 1 с

10 мм – 100 с

Предполагают, что частица удовлетворяет условию ρC_p/k=250;

ρ – плотность частицы,

C_p – теплоемкость,

k – теплопроводность.

По организации процесса стерилизации различают непрерывную и периодическую.

Зависимость времени периодической стерилизации промышленного ферментатора от t.

t_o – точка отсчета

t₁ – время достижения 121^оС

t₂ – начало охлаждения

t₃ – завершение цикла стерилизации

Для больших емкостей (V=100 м³) продолжительность нагревания и охлаждения может составлять несколько часов, а выдержка при 121^оС обычно 15 мин.

Кривая температуры построена по уравнению

Большинство процессов осуществляется непрерывно, поэтому следует разграничить стадии подготовки ПС и ферментации.

На следующем рис. показана схема парового стерилизатора инжекционного типа.

Достоинства непрерывной стерилизации: эффективное использование пара и незначительное разрушение чувствительных к теплу элементов среды.

Количество С, необходимое для б/с и снабжения энергией, учитывается в виде коэффициента выхода V. Для определения количества углерода, необходимого для роста клеток, плотность клеток делят на предполагаемый выход клеточной массы. Например, для получения 30 г/г клеток из метана (при выходе 0,5 г/г метанола) требуется 60 г/л метанола.

Вторым крайне необходимым элементом является кислород. Он слабо растворяется в реакционной массе, в связи с чем обеспечение процесса ферментации О₂ зависит от массопереноса.

Конечным продуктом стадии ферментации является пища, поэтому ее приготовление, обработку следует осуществлять в стерильных условиях.

С целью разрушения загрязняющих веществ осуществляют стерилизацию среды и воздуха.

Существует много методов стерилизации среды. Их условно можно разделить на 2 группы:

Извлечение м/о	Разрушение м/о
- фильтрация - центрифугирование - флотация - электростатическое притяжение - ионный обмен - адсорбция	- нагревание (сухое и влажное) - воздействие химических реагентов - электромагнитные и звуковые колебания

В промышленности используется в основном пар. Поэтому данный метод рассматривается более подробно.

Термическое разрушение м/о зависит от t и времени: чем выше температура, тем меньше время жизни клеток.

Кинетика гибели клеток при температурном воздействии описывается уравнением:

dN/dt=-kN,

где N – число жизнеспособных клеток в 1 мл;

t – время, мин;

k – константа, мин^-1.

Проинтегрировав выражение по начальному и конечному уровню загрязнений N₀ и N соответственно

ln N₀/N=kt

Определенные затруднения возникают при определении N₀ и N. Кроме того, нет ясности, что в действительности подразумевается под гибелью клеток.

Схема нагревания и охлаждения ферментатора при стерилизации ПС

Следует иметь в виду, что обработка ПС острым паром приводит к образованию конденсата. В связи с этим необходимо заранее учитывать разбавление среды конденсатом и вносить соответствующую поправку в рецептуру ПС.

При циклической стерилизации поддерживают t=121^oC (р=100кПа). Обычно ПС выдерживают при такой температуре 30 – 40 мин. Полный цикл нагревания, выдержки и охлаждения для ферментаторов большого объема достигает нескольких часов.

Необходимое условие успешной стерилизации ПС – тщательная гомогенизация ее твердых компонентов.

Длительность выдержки (при t_стер) крупных частиц, медленно прогревающихся при стерилизации, бывает меньше расчетной, и в них сохраняется посторонняя микрофлора, способная инфицировать культурную жидкость.

Длительная тепловая стерилизация приводит к определенным химическим изменениям в составе ПС: разложению термолабильных соединений, образованию новых соединений – ингибиторов. Эффективная стерилизация при минимальном изменении состава среды может быть достигнута применением более высокой температуры, быстрым нагреванием и охлаждением среды. Так как скорости гибели спор и разложения витаминов и ферментов при нагревании существенно различаются, поэтому, в настоящее время, циклический метод применяют для стерилизации среды только в аппаратах малого объема.

ln k 1

споры

термолаб.

1/T

Метод высокотемпературной непрерывной стерилизации, используемый на большинстве заводов дает возможность свести к минимуму ухудшение питательных качеств среды без снижения эффективности самой стерилизации.

На рисунке показано изменение температуры элементарного объема жидкости при периодической и непрерывной стерилизации в зависимости от продолжительности. Как видно из рисунка при непрерывной стерилизации можно значительно сократить время стерилизации, а следовательно снизить расход пара. Кроме того непрерывная стерилизация легче поддается автоматизации.

t ^o 1 II 2

I III

t

Применение более высоких t, чем при циклической стерилизации, позволяет резко сократить продолжительность выдерживания среды при t_max, а периоды нагревания и охлаждения осуществить за несколько секунд.

Если питательная среда не содержит суспензированных частиц, то t=150-160 ^oC, (1 мин) обеспечивает мгновенную стерилизацию. При наличии твердых суспензированных частиц в среде оптимальная для стерилизации температура должна быть ниже, так как требуется более длительное время для прогревания таких частиц. В этом случае температура стерилизации равна 135 ^oC, а длительность выдержки – 5-15 мин.

Установка непрерывной стерилизации состоит из последовательно соединенных аппаратов: нагревателя, выдерживателя и холодильника.

Приготовленная в отдельной емкости ПС насосом прокачивается через УНС в заранее простерилизованный ферментатор.

Рис. 9.3 – Установка непрерывной стерилизации УНС питательной среды: 1–секции выдерживателя стерилизатора, 2–рекуператор тепла, 3–теплообменник, 4–нагревательная колонка, 5–насос.

Нагреватель – аппарат, предназначенный для быстрого нагревания среды до температуры стерилизации при наименьшей затрате пара. Конструкция нагревателя в зависимости от режима работы может быть различной. Наибольшее распространение получили нагреватели в виде колонны, парового инжектора, двухтрубные и пластинчатые. (Рассмотрим нагревательную колонну для стерилизации ПС. Наружная труба колонны является корпусом, в которую помещена внутренняя трубу со щелевидными прорезями. Пар подается вверху внутренней трубы и через прорези поступает в среду. ПС подается снизу и движется вверх по спирали, благодаря наличию винтовых направляющих. Время нагревания среды 10-15 с. Аппарат отличается простотой, малыми размерами, но работа его сопровождается гидравлическими ударами при конденсации пара.)

Выдерживатель – аппарат для выдерживания ПС при определенной температуре стерилизации. Чтобы каждый объем среды находился в выдерживателе определенное время, аппарат должен работать по принципу полного вытеснения. (На схеме изображен трубчатый выдерживатель (стерилизатор). Он состоит из трех труб, соединенных последовательно штуцерами. На выходной трубе установлен автоматический регулятор давления в соответствии с t^o стерилизации.) Выдерживатель оборудован манометром и термометрами.

Холодильник – аппарат для охлаждения ПС после стерилизации. Охлаждение осуществляется через стенку с помощью водопроводной воды, которая циркулирует в рубашке. Имеются холодильники пластинчатого типа и двухтрубные теплообменники (типа труба в трубе). (На схеме представлен теплообменник типа труба в трубе. ПС подается по внутренней трубе, а охлаждающая вода движется противотоком в рубашке. Теплообменник должен хорошо сохранять герметичность, так как попадание воды в стерильную среду может вызвать инфицирование.) Холодильники – наиболее крупные и дорогостоящие аппараты УНС.

Рассмотрим математическое описание процесса термической стерилизации.

Гибель (отмирание, разрушение) м/о под действием тепла можно описать уравнением

dN/dτ=-kN,

где N – количество жизнеспособных м/о (спор) в объеме стерилизуемой жидкости к моменту τ, k – константа удельной скорости гибели спор, мин^-1.

После интегрирования этого уравнения в пределах от N₀ до N и от 0 до τ получаем:

Ln(N₀/N)= (1)

или N=N₀l^-kτ

здесь N₀-количество жизнеспособных м/о во всем объеме жидкости до стерилизации (τ=0).

Левую часть уравнения, которая характеризует убыль жизнеспособных спор, согласно обозначениям, принятым Дейндорфером и Хэмфри можно выразить через Δ=ln N₀/N, где Δ – безразмерный критерий стерилизации, используемый при оценке различных ее режимов.

Влияние температуры на изменение константы можно выразить уравнением Аррениуса

k=Ae^-E/RT, (2)

тогда формула (1) принимает вид

Δ=А ^-Е/RTdτ, (3)

Где А-константа Аррениуса (стерический фактор), мин^-1, Е – энергия активации, необходимая для гибели спор Дж/моль, R-универсальная газовая постоянная Дж/(моль*К), Т – температура стерилизации, К.

Для расчета эффективности стерилизации по уравнению (3) необходимо знать энергию активации гибели спор и константу Аррениуса.

При выборе режимов стерилизации пользуются в основном константами гибели наиболее термически устойчивых спор бактерий Bacillus stearothermophilus штамма 1518. Существуют таблицы зависимости k и Δ от t.

Физически более обоснованным для расчета эффективности стерилизации является метод Дейндорфера – Хэмфри, в котором суммарное значение критерия стерилизации находится по формуле

∑Δ= Δ_н + Δ_в + Δ_охл ,где

Δ_н ,Δ_в ,Δ_охл – критерии стерилизации на стадии нагрева, выдержки и охлаждения соответственно.

При постоянной температуре (на стадии выдержки) Δ_в = ln N₀/N=kτ_в. Отсюда время выдержки при выбранной температуре

τ_в= 2,3/k*lgN₀/N

Зная t^o_ст находят k - количество жизнеспособных спор во всем объеме. ПС до стерилизации N_o=10⁶C₀V_ж, где С₀ – количество спор в 1 мл. среды (находится экспериментально или принимается равным 1700-2000), V_ж – объем стерилизуемой жидкости, м³.

Для расчета критерия стерилизации, достигаемого на стадии нагревания и охлаждения, используется метод Ричардса: предполагается, что стерилизующий эффект обеспечивается при температуре > 100 ^оС, а зависимость t^o от времени в рассматриваемом диапазоне температур является линейной. Тогда критерий стерилизации рассчитывается из уравнения:

Δ_{н охл} = Δ_Т×τ_{н охл}/( t_ст-100)

t_ст – температура стерилизации, ^оС

Δ_Т – табличное значение критерия стерилизации при данной температуре

τ_{н охл} – продолжительность изменения температуры от 100 ^оС до t_ст при нагревании или охлаждении в минутах, мин

Установлено, что стерилизации жидких ПС эффективна при критерии стерилизации около 40. Однако с учетом ряда факторов (наличие конгломератов, неравномерность скорости прогрева среды и т. д.), чтобы обеспечить гарантийную стерильность в производственных условиях следует принять критерий в пределах 80-100.

При культивировании некоторых м/о требуется вводить в состав ПС термолабильные компоненты, которые не могут быть подвергнуты тепловой стерилизации. Эти компоненты стерилизуют отдельно, а затем асептически вносят в стерильную среду. Для их стерилизации применяют облучение или фильтрование через специальные (обеспложивающие) фильтры.

Стерилизация ионизирующим излучением находит ограниченное применение в МБП. Примером промышленного использования γ-лучей от источника С₀⁶⁰ является производство ризоторфина, где торф перед смешиванием его с м/о стерилизуется этими лучами. Ограниченное применение ионизирующих излучений при стерилизации обусловлено высокой устойчивостью м/о к радиации и в связи с этим значительными расходами на стерилизацию.

В последние годы все чаще применяют стерилизацию, основанную на использовании полупроницаемых мембран. Наряду с очевидными достоинствами (низкая энергоемкость, отсутствие вредного воздействия на термолабильные компоненты). Этот метод не пригоден для обработки вязких питательных сред, содержащие твердые включения. Для исключения этого недостатка можно применить раздельную обработку компонентов питательных сред: воду и солевые растворы стерилизовать путем микрофильтрации, а концентрат, содержащий твердые частицы, в УНС. Это позволяет резко сократить объем жидкости, стерилизуемой термическим методом, расходы пара и охлаждающей воды. При соотнесении объемов концентрата и солевых растворов 1:3 переход на комбинированный метод стерилизации позволяет снизить энергетические затраты на 73% по сравнению с тепловой стерилизацией.

Схема установки для стерилизующей фильтрации жидкостей: 1 – сборник, 2 – фильтр, 3 - буферная емкость, 4 – насос, 5 – мембранный аппарат.

Стерилизуемая жидкость под давлением сжатого воздуха проходит через фильтр предварительной очистки от крупных частиц и поступает в буферную емкость. Очищенный раствор с помощью циркулярного насоса подается в мембранный фильтрационный аппарат, из него в ферментатор, а остальная часть раствора возвращается в буферную емкость.

Рециркуляция жидкости в данной технологической схеме осуществляется для того, чтобы создать интенсивный поток жидкости над мембраной, способствующий очищению ее поверхности. Поскольку концентрация твердых частиц в циркулирующем потоке раствора мала, слой осадка на поверхности мембраны практически не образуется и ее гидравлическое сопротивление не меняется в течение длительного времени.