Хід роботи.

Обладнання: 1. Колонка розміром 1.230 см, упаковану сефадексом G-25 (середній);

2. Спектрофотометр СФ-46, або ФЕК- .

3. Штатив з пробірками.

Реактиви: 1. Метміоглобін (MetMb) – очищений попередньо за допомогою гель-фільтрації через колонку з сефадексом, як описано у п. 3.5.2..

2. K₃Fe(CN)₆ .

3. Гваякол – 0,6 мл розплаву розчиняють в 100 мл води і доводять об’єм до 200 мл (це відповідає концентрації гваякола 27мМ).

4. Гідроген пероксид.

5. 0,1 н ацетатний буфер, рН 5,33.

Підготовка реактивів.

1. Приготування розчину Н₂О_2. Вихідний розчин Н₂О₂ розводять до концентрації 0,05 Н (25 мМ). Для цього беруть 0,5 мл свіжого гідроген пероксиду розводять дистильованою водою до 150 мл і визначають на спектрофотометрі поглинання при 440 нм, або при 470 нм. Враховуючи коефіцієнт мілімолярної екстинкції при відповідній довжині хвилі визначають нормальність одержаного розчину.

Коефіцієнт мілімолярної екстинції:

Н₂О₂ = 22,2 мМ^-1см^-1 (440 нм)

Н₂О₂ = 26,6 мМ^-1см^-1 (470 нм)

При довжині хвилі 240 нм коефіцієнт мілімолярної екстинції Н₂О₂ = 43,6 мМ^-1см^-1.

2. Для приготування ацетатного буферу змішують 86 мл заздалегідь приготовленого 0,2 М оцтовокислого натрію і 14 мл 0,2 М оцтової кислоти, доводять об’єм водою до 200 мл.

Підготовка міоглобіну. До очищеного від сірчанокислого амонію розчину міоглобіну додається в надлишку кристалічний (K₃Fe(CN)_6.) для повного переведення його у метформу. Розчин піддається гель-фільтрації на колонці з сефадексом G-25 для очистки від надлишку (K₃Fe(CN)₆).

Використовуючи спектрофотометричний метод і коефіцієнт мілімолярної екстинції (мМ), визначають концентрацію метміоглобіна, що піддавався гель-фільтрації. Розводять бідистильованою водою до концентрації 20-25 мкг/мл.

Хід визначення:

1. Реакційну суміш для визначення пероксидазної активності метміоглобіну готують за схемою:

Vмл MetMb + (2-V) мл Н₂О + 2 мл буфера + 0,5 мл гваяколу

(0,5 MetMb + 0,5 мл Н₂О + 1 мл буфера + 0,25 мл гваяколу)

2. Суміш переносять в спектрофотометричну кювету.

3. Як контроль використовують таку ж суміш. Однак, замість гідроген пероксиду вносять ту ж кількість води.

4. В дослідну пробу вносять 0,5 (0,25) мл гідроген пероксиду, швидко перемішують, закривають кювету і проводять спектрофотометрування зразка. Початок реакції відраховують з часу введення Н₂О₂. Спостерігається утворення забарвленого комплексу, кількість якого зростає, повязаної з розщепленням Н₂О₂ , вивільненням .

5. За ходом реакції спострерігають по зміні поглинання світла при 440 нм за допомогою спектрофотометра СФ-46 або ФЕК. поглинання фіксують

Величину Т (пропускання), або Д (поглинання) проводять через кожні 30 с.

Краще перевести значення Т в значення Д (поглинання): Д = 2 – lg Т.

6. Пероксидазну активність визначають за формулою:

А = ΔD· V · 1000/ε · a· c,

де : А – пероксидазна активність MetHb;

ΔD – середнє значення вимірювання оптичної густини проби при довжині хвилі 440 нм;

V - загальний об’єм суміші у кюветі;

1000 – коефіцієнт перерахунку від мікромоля до наномоля;

ε - коефіцієнт мілімолярної екстинкції ( 6,22 мкм^-1·см^-1);

a – об’єм зразка у кюветі;

c – концентрація міоглобіну (зразка).

7. Будують кінетичну криву, як функцію Д = f(t) і знаходять початкову швидкість пероксидазної реакції по тангенсу кута прямолінійної кривої в одиницях оптичної густини (швидкість реакції виражають в мкМ/с, використовуючи множинник 11,23, одержаний калібровкою за допомогою окисної системи Ag⁺ -S₂O₈^2--.

Графік стр. 82.Міоглобіни

Рис.3.5.3.1. Кінетичні криві пероксидазної активності мет-Мb