Хід роботи:

Одержання дрібнопористого гелю:

Дрібнопористий гель готували в співвідношенні:

А:С: персульфат :Н₂О = 1:2:4:1

Приготовану суміш добре перемішували і заливали в скляні трубочки, які попередньо були запарафіновані з одного кінця. Висота стовбчика, утвореного сумішю в гелі, повинна складати 5-7 см. При внесенні в трубочку слідкувати, щоб не утворювались пухирці. Для створення рівної поверхні гелю зверху на суміш вносять за допомогою шприца декілька крапель бідистиляту. Нашаровувати обережно, щоб не відбувалося змішування із сумішю майбутнього гелю. Полімеризувати в термостаті при температурі 37С.

Одержання крупнопористого гелю:

Крупнопористий гель готували в співвідношенні: 1

B:D:E:F = 1:2:1:4

В кожну трубочку на отриманий дрібнопористий гель нанести крупнопористий висотою по 0.2-0.4 мл приготованої суміші. Зверху так само нашаровують воду. Полімеризували дрібнопористий гель за допомогою ультрафіолету (на протязі  20 хвилин – доки не стане молочно-білим). Забрати фільтрувальним папером воду, перед нанесенням зразка.

Нанесення зразка: Концентрація зразка, що вводиться в трубочку, складає 100-150мкг. Для швидкого визначення концентрації білка можна використовувати спектрофотометричний метод, знаючи коефіцієнт екстинції. Зразок, що вноситься, змішують з 40% розчином сахарози. Об’єм зразка з сахарозою не повинен перевищувати об’єму концентруючого геля.

Електрофорез: Трубки виймають із штативу. знімають парафінове дно, поміщають в електродну камеру. При введені трубок у буфер нижньої електродної камери необхідно слідкувати за тим, щоб на кінцях трубок не було пухирців повітря.

Електрофорез проводити в тріс- гліциновому буфері рН 8,3 на протязі 20 хвилин при силі струму 2 мА на трубочку , а потім при силі струму на одну трубочку складає 4 мА. В якості індикатора використовують бромфеноловий синій, який додають по краплі у верхній буфер (в трубочки). Підключаються електоди так, щоб “плюс” знаходився у нижній камері, а “мінус” – у верхній. В загальному електофорез протікає 1,5-2 години, доки мітка не почне виходити з трубочок.

Фіксування: По закінченню електрофореза гелі видаляються шприцем з тонкою голкою (з водою) і залежно від того чи будемо проводити визначення активності ферментів (1) чи білкових зон (2) занурююмо в розчини: в першому випадку – в рекційну суміш, а в другому - фіксуються 5%-ним розчином ТХО або 7%-ним розчиним оцтової кислоти на протязі 15-20 хвилин, потім відмиваються водою.

Фарбування: фарбуються на протязі 1 години 0,1% розчином Кумассі або амідочорного, надлишок фарби відмивають 7%-ним розчином оцтової кислоти.

Обробка результатів: Одержані результати деситометрують на денситометрі і проводять обробку електрофореграм чи проводили визначення коефіцієнту рухливості (Rf) для кожної з виявлених білкових зон за формулою:

Rf = S₁/S, де

S₁ – пробіг, який пройшла речовина, для якої визначається Rf,

S – загальний пробіг при електорофорезі (від старту до мітки)