- •1 Обзор литературы
- •1.1 Клиническое значение бактерий семейства Enterobacteriaceae
- •1.3 Выбор антибактериальных препаратов для лечения кишечных инфекций
- •2 Материалы и методы исследований
- •2.1 Объекты исследования
- •2.2 Среды и растворы
- •2.3 Методы исследования
- •3 Результаты исследований
- •3.1 Количество случаев оки, вызванных бактериями кишечной группы семейства Enterobacteriaceae
- •3.2.Выбор антибактериальных препаратов при кишечных инфекциях
- •4 Обсуждение результатов
ВВЕДЕНИЕ
Широко распространенный термин “кишечные инфекции” относится к большой группе инфекционных заболеваний с преимущественным поражением желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) и соответствующей симптоматикой (диарея, боли в области живота, в подложечной области, тошнота, иногда рвота, в тяжелых случаях – выраженная интоксикация, обезвоживание) (Падейская Е.Н.,1997). Этиологическая структура возбудителей инфекционных процессов в последнее десятилетие изменилась: значительно увеличился удельный вес заболеваний, вызываемых условно-патогенными микроорганизмами и некоторыми другими видами микроорганизмов, роль которых в инфекционной патологии ранее была неизвестна (Исаков Ю.Ф., 1985).
Инфекционные диареи различного генеза широко распространены в разных регионах мира, могут протекать в тяжелой форме с выраженной токсинемией, в развивающихся странах остаются одной из основных причин заболеваемости и смертности (Покровский и др., 1994).
Определение чувствительности микроорганизмов – возбудителей инфекционных заболеваний человека к антибактериальным препаратам приобретает все более важное значение в связи с появлением и широким распространением антибиотикорезистентности у бактерий (Семина и др., 2004).
Выбор препарата и схемы его назначения (дозы, длительность курса) в качестве монотерапии или в комбинации с другими антимикробными средствами должны рассматриваться в зависимости от нозологической формы заболевания с учетом сроков начала лечения, стадии болезни, тяжести процесса, возможности развития осложнений и формирования бактерионосительства. Кишечные инфекции могут осложнять то или иное инфекционное или неинфекционное заболевание.
Цель работы: выделение и идентификация возбудителей острых кишечных инфекций, а также определение чувствительности к антибиотикам выделенных энтеробактерий кишечной группы.
1 Обзор литературы
1.1 Клиническое значение бактерий семейства Enterobacteriaceae
Кишечные инфекции возникают часто и имеют существенное значение в качестве причины смерти, как у детей, так и у взрослых.
Возбудителями этих инфекций могут быть различные бактерии, наиболее важное значение среди них занимают бактерии из семейства Enterobacteriaceae (сальмонеллы, шигеллы, эшерихии, иерсинии, а также клебсиелы).
Общим для этой группы инфекций является орально-фекальный путь заражения (через пищу, воду, контактно-бытовым путем – “болезни грязных рук”), входные ворота инфекции – ЖКТ, основные формы заболевания – гастроэнтерит, энтероколит, колит, гастроэнтероколит или гастрит. При тяжелых формах инфекции (в том числе на фоне иммунодефицитных состояний) могут иметь место токсинемия или бактериемия, реже – септицемия или септикопиемия. (Рахманова и др., 1995). Разнообразие клинических форм кишечных инфекций, вызываемых некоторыми представителями семейства Enterobacteriaceae представлено в таблице 1.
Таблица 1
Возбудители и клинические формы кишечных инфекций (Падейская Е.Н.,1997)
Salmonella typhi, S. paratyphi А и В |
Брюшной тиф Паратифы А и В |
Острое инфекционное заболевание с циклическим течением; поражение ЖКТ, воспалительный процесс в лимфатическом аппарате кишечника (до некроза), бактериемия, интоксикация. Бактерионосительство. |
Salmonella spp., чаще – S. typhimurium, S. enteritidis, S. heidelberg, S. panama Shigella spp.: S. dysenteria, S. flexneri, S. sonnei |
Сальмонеллез
Шигеллез
|
Гастроэнтерит, колит; реже – генерализованная инфекция. Бактерионосительство. Поражение дистального отдела толстой кишки (колитическая форма); возможны гастроэнтероколит, общая интоксикация, редко – бактериемия |
Escherichia coli – токсигенные, энтеропатогенные штаммы |
Эшерихиоз |
Интоксикация, поражение ЖКТ (слизистой толстой кишки), иногда “холероподобный эшерихиоз”, возможен геморрагический колит с гемолитической уремией |
Кишечные инфекции у человека могут вызывать только представители родов Shigella, Escherichia, Salmonella.
1.1.1 Шигеллезы
Дизентерия (шигеллезы) — острое инфекционное заболевание, характеризующееся синдромом общей интоксикации и поражением желудочно-кишечного тракта. Вызывается различными родами шигелл. (Никифоров и др., 2000). В состав рода Shigella входит 4 вида бактерий: шигеллы дизентерии, Флекснера, Бойда и Зонне. Всего насчитывается около 40 различных сероваров шигелл. Наиболее вирулентной считается шигелла Григорьева-Шига.
Эпидемиология дизентерии. Заболевание относится к типичным кишечным инфекциям с фекально-оральным механизмом передачи. Единственным источником инфекции является больной человек. (Бочков и др., 2001). Заболевание возникает спорадически или приобретает эпидемический характер, когда большую роль в распространении инфекции играют пищевые продукты (чаще — шигеллы Зонне) и вода (чаще — шигеллы Флекснера).
Клиника дизентерии. Инкубационный период составляет 2-4 дня. Заболевание развивается остро. Повышается температура тела, которая у большинства больных держится 2-3 дня. Беспокоят слабость, недомогание, головная боль, озноб, снижение аппетита. У больных возникают боли в животе, носящие схваткообразный характер. Боли могу быть разлитыми, но чаще локализуются в левой подвздошной области. Появляется жидкий стул со слизью и прожилками крови. Стул становится скудным, приобретая типичный дизентерийный характер в виде ректального плевка.
Классификация дизентерий:
• Голитическая форма.
• Гастроэнтероколитическая форма.
• Стертая форма.
• Субклиническая форма.
• Бактерионосительство (реконвалесцентное, транзиторное).
Кроме того, различают острую и хроническую форму. Хроническая дизентерия может протекать в двух вариантах — непрерывном и рецидивирующем.
1.1.2 Эшерихиозы
Эшерихиозы (коли-инфекции) – острые инфекционные заболевания с фекально-оральным механизмом передачи; характерно преимущественное поражение ЖКТ с развитием энтерита или энтероколита, в редких случаях–генерализованных форм с внекишечными проявлениями (Чистенко и др., 2005).
В настоящее время известно около 170 антигенных вариантов Е. coli; более 80 из них вызывают коли-инфекцию. Диареегенные серовары кишечной палочки разделяют на 5 групп:
-энтеропатогенные (ЭПКП);
-энтеротоксигенные (ЭТКП);
-энтероинвазивные (ЭИКП);
-энтерогеморрагические (ЭГКП);
-энтероадгезивные (ЭАКП).
Эпидемиология эшерихиозов. Резервуар и источник инфекции – человек, больной или носитель. Большую эпидемическую опасность представляют больные; среди них наиболее опасны больные эшерихиозами, вызванными ЭПКП и ЭИКП, менее – больные эшерихиозами, обусловленными ЭТКП, ЭГКП и ЭАКП. Механизм передачи – фекально-оральный, пути передачи – пищевой, водный и бытовой.
Патогенез эшерихиозов. Механизмы развития заболеваний зависят от принадлежности диареегенных эшерихий к конкретным группам.
Энтеропатогенные эшерихии – это главным образом вызывают заболевание у детей раннего возраста с поражением преимущественно тонкой кишки. (Носов, 1972). Патогенез поражений обусловлен адгезией бактерий к эпителию кишечника и повреждением микроворсинок, но не инвазией в клетки.
Энтеготоксигенные эшерихии – основные возбудители «диареи путешественников» и детской диареи в странах Третьего мира. Факторами патогенности являются пили-, или фимбриальные, факторы, облегчающие адгезию к эпителию и способствующие колонизации нижних отделов тонкой кишки, а также определяющие способность к токсинообразованию. Выделяют термолабильный, термостабильный энтеротоксин. Эффект высокомолекулярного термолабильного токсина аналогичен действию токсина холерного вибриона [активация аденилатциклазной системы с образованием циклического аденозин 3',5'-монофосфата (цАМФ) и циклического гуанозинмонофосфата (цГМФ)]. Эти возбудители часто становятся этиологическим фактором секреторной диареи у взрослых и детей.
Энтероинвазивные эшерихии могут проникать и размножаться в клетках эпителия кишечника. Они неподвижны и часто не способны ферментировать лактозу (Борисов и др., 1994). Повреждение эпителия способствует увеличению всасывания в кровь эндотоксина бактерий.
Энтерогеморрагические эшерихии, проникая в кровь, усиливают токсическое действие ЛПС-комплекса, что может приводить к развитию гемолитико-уремического синдрома и полиорганной недостаточности (ДВС-синдрому, ИТШ, поражению эндотелия сосудов в клубочках почек и ОПН) (Егорова и др., 2001).
Энтероадгезивные эшерихии не образуют цитотоксины, не инвазируют клетки эпителия, не имеют плазмидный фактор адгезии, могут агрегироваться на поверхности клеточных слоёв. Группа энтероадгезивных эшерихий остаётся наиболее плохо изученной (Покровский и др., 1999).
1.1.3 Сальмонеллёзы
Сальмонеллёз относится к группе острых заболеваний, как людей, так и животных, возбудителями которых являются бактерии рода сальмонелл. Заболевания распространены повсеместно, природный резервуар большинства возбудителей – человек и различные животные. Основные пути передачи – водный и пищевой, реже – контактный путь передачи возбудителя (Никифоров и др., 2000).
Основные заболевания, вызываемые сальмонеллами, можно условно разделить на 3 группы: брюшной тиф и паратифы, гастроэнтериты, септицемии (Митрохин, 2005).
У сальмонелл адгезию к клеткам эпителия обеспечивают пили 1-го (манноза-чувствительные), 3-го и 4-го типов. Сальмонеллы не способны самостоятельно проникать в эпителиальные клетки ЖКТ, а попадают в них посредством эндоцитоза. Бактерии мало приспособлены к размножению в эпителии и, достигая базальной мембраны, попадают в соединительно-тканную собственную пластинку (lamina propria), в брыжеечные лимфатические узлы, откуда они проникают в кровоток. Однако большинство сальмонелл не вызывают клинических проявлений бактериемии, т.к. быстро элиминируется фагоцитами. Исключения – S.typhimurium и S.enterica, способные вызывать септицемии.
Возбудители размножаются в lamina propria, вызывают развитие местной воспалительной реакции и приток жидкости в очаг поражения, а также вырабатывают энтеротоксины, повышающие уровень цАМФ, активирующие синтез простогландинов или нарушающие синтез белка. В отличие от прочих сальмонелл, возбудители брюшного тифа и паратифов, проникнув в кровоток, способны выживать и размножаться в фагоцитах, а после гибели последних в больших количествах высвобождаться в кровь. При этом антиген вирулентности (Vi-Аг) ингибирует действие сывороточных и фагоцитарных бактерицидных факторов. Погибшие сальмонеллы высвобождают эндотоксин, который угнетает деятельность ЦНС. Бактериемия приводит к генерализованному инфицированию различных органов и вторичной инвазии эпителия кишечника (Покровский и др., 1999).
1.2 Идентификация бактерий семейства Enterobacteriaceae
Забор проб и доставка проб в лабораторию производится, согласно Международному стандарту ISO/FDIS15189 с соблюдением следующих правил: в пределах времени, соответствующем природе запрашиваемого исследования; в рамках температурного интервала, указанного в руководстве по взятию первичной пробы и предназначенной для обеспечения сохранности пробы; способом, который обеспечивает безопасность лаборатории.
Для забора проб и обеспечения сохранности пробы используют специальную посуду (табл.2).
Таблица 2
Посуда, используемая для доставки проб в лабораторию (Савицкая и др., 2005)
Источник и вид клинического материала |
Изделия, используемые для доставки пробы |
Ректальный мазок |
Одноразовый стерильный зонд-тампон, вмонтированный в стерильную сухую пробирку (тубсер); или стерильная пробирка со специальной транспортировочной средой; зонд-тампон из нержавеющего материала, вмонтированный в целлюлозную или ватно-марлевую пробку стерильной стеклянной пробирки |
Фекалии на наличие кишечных инфекций |
Стерильная пробирка с тампоном в физиологическом растворе с глицерином; контейнер транспортировочный со средой для анаэробов в фекальных образцах; зонд-тампон в сухой стерильной одноразовой пробирке (тубсер); стерильная стеклянная пробирка, смонтированная с зондом-тампоном на металлической проволоке из титана, стали, алюминия. |
При выделении из клинических образцов принадлежность к семейству Enterobacteriaceae обычно устанавливают по основным морфологическим признакам и наличию (или отсутствию) определённых ферментов, обеспечивающих метаболизм бактерий (Покровский и др., 1999). Морфологические свойства изучаются путем бактериоскопии диагностического материала и мазков из колоний, выросших на плотных и жидких питательных средах культур. Мазки на предметных стеклах фиксируют на пламени горелки или в жидких фиксаторах, окрашивают по Граму. Бактериоскопическое исследование является ориентировочным. Дальнейшее исследование включает посев материала на питательные среды, выделение чистых культур, их идентификацию и определение лекарственной чувствительности. Культуральные свойства изучают при просмотре выросших культур на плотных и жидких питательных средах. На плотных средах учитывают размер колоний, цвет, прозрачность, форму, наличие пигмента, гемолиз вокруг колонии и его характер и т.д. На жидких средах отмечают их прозрачность, наличие осадка (придонный рост) или пленки на поверхности среды (Калюк, 1991).
Исследование биохимических свойств основывается на определении ферментативной сахаролитической активности, способности утилизировать питательные вещества в аэробных и анаэробных условиях культивирования. Антигенные свойства культур изучаются при взаимодействии бактерий и их антигенов с соответствующими антисыворотками (реакции агглютинации, иммунофлюоресценции и др.). После изучения морфологических и культуральных свойств осуществляют постановку дифференциальных тестов с чистыми культурами микроорганизмов (Калюк, 1991).
К семейству Enterobacteriaceae относятся грамнегативные палочки, хорошо растущие на обычных питательных средах, подвижные или неподвижные, расщепляющие глюкозу путем ферментации, не имеющие цитохромоксидазы, редуцирующие нитраты в нитриты. После установления принадлежности штамма к Enterobacteriaceae определяют внутри семейства другие таксономические свойства. При этом основное значение имеет изучение ферментативной характеристики культур. Биохимические признаки кишечных бактерий в пределах рода непостоянны. Поэтому при идентификации используют ряд биохимических тестов, а также изучают аминокислотный метаболизм. Дифференциация проводится до определения рода микроорганизма. Принадлежность микроба к одному из родов семейства Enterobacteriaceae устанавливается по ряду биохимических тестов. Изучают подвижность, ферментацию глюкозы, лактозы, маннита, разложение мочевины, усвоение цитрата, разжижение желатины, образование индола и сероводорода, утилизацию малоната, дезаминирование фенилаланина, декарбоксилирование лизина. В таблице 3 представлены основные признаки межродовой дифференциации семейства Enterobacteriaceae. Полная идентификация до рода включает до 25 биохимических тестов (Калюк, 1991). В таблице 4 показаны основные признаки внутриродовой дифференциации некоторых представителей семейства Enterobacteriaceae.
Таблица 3
Основные признаки межродовой дифференциации семейства Enterobacteriacea
|
Тест или субстрат |
Esсherichia |
Shigella |
Salmonella |
По результа- там посева на комбини- рованную среду (Оль- кеницкого или сходную) |
Лактоза |
+,- |
- |
- |
Глюкоза (газ) |
+,- |
- |
+,- |
|
Сероводород |
- |
- |
+,- |
|
Мочевина (ориентир) |
- |
- |
- |
|
Дополнитель- ные тесты для опреде- ления родо- вой принад- лежности |
Цитрат Симмонса |
- |
- |
+,- |
Мочевина (по Кристенсену или Преусу) |
- |
- |
- |
|
Индол |
+,- |
+,- |
- |
|
Тест с метило- вым красным |
+ |
+ |
+ |
|
Тест Фогеса- Проскауэра |
- |
- |
- |
|
Фенилаланинде- заминаза |
- |
- |
- |
|
Лизиндекарбок- силаза |
+,- |
- |
+,- |
|
Подвижность |
+,- |
- |
+ |
|
Ацетат |
+ (+) |
- |
х |
+ – 90% и более положительных реакций.
(+) – Замедленно положительные реакции (через двое и более суток).
- – 90% и более отрицательных реакций.
+,- – чаще положительные, реже отрицательные реакции.
х – различные биохимические реакции.
Таблица 4
Основные признаки внутриродовой дифференциации некоторых представителей семейства Enterobacteriaceae
Тест или субстрат |
Shigella |
Salmonella |
||||||
dysent. |
flexner. |
boydii |
sonnei |
подроды |
||||
I |
II |
III |
IV |
|||||
Дульцит |
|
|
|
|
+ |
+ |
- |
- |
Маннит |
- |
+ |
+ |
+ |
|
|
|
|
Салицин |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
Сорбит |
х |
х |
х |
- |
|
|
|
|
Сахароза |
- |
- |
- |
(+) |
|
|
|
|
Малонат |
|
|
|
|
- |
+ |
+ |
- |
Желатин |
|
|
|
|
- |
(+) |
(+) |
(+) |
Орнитин-декарбоксилаза |
- |
- |
- |
+ |
|
|
|
|
Лактоза |
- |
- |
- |
(+) |
- |
- |
+,х |
- |
Глюкоза (газ) |
- |
-,+ |
- |
- |
|
|
|
|
Индол |
|
|
|
- |
|
|
|
|
Лизин-декарбоксилаза |
- |
- |
- |
- |
|
|
|
|
После определения родовой принадлежности бактерий, изучают их лекарственную чувствительность.