Билет 9

6. Определение антимикробной активности антибиотиков основано на их способности угнетать рост микроорганизмов. Определение проводят методом диффузии в агар на плотной питательной среде путем сравнения размеров зон угнетения роста тест - микробов, образующихся при испытании растворов определенных концентраций Государственного стандартного образца и испытуемого препарата. Антимикробная активность антибиотиков выражается в единицах действия - ЕД или "мгк". Для большинства ан тибиотиков 1 ЕД или "мкг" соответствуют! мкг активного вещества; для антибиотиков, имеющих иное количественное выражение единицы, соответствующие указания даются в частных статьях. При определении антимикробной активности антибиотиков используют стандартные образцы, активность которых, как правило, устанавливают в соответствии с Международными биологическими стандартами. При отсутствии последних для указанных целей могут быть использованы международные химические стандарты, антимикробную активность которых рассчитывают на основании показателей качества, установленных физико-химическими методами. Антимикробную активность стандартных образцов антибиотиков, не имеющих аналогов в международной коллекции стандартов, рассчитывают также на основании показателей качества, установленных физико-химическими методами.

■ Метод определения. В чашки Петри (стеклянные или пластмассовые), установленные на столиках со строго горизонтальной поверхностью, разливают расплавленные питательные среды определенного состава в один или два слоя. Для нижнего слоя используют незасеянные среды, для верхнего или одного слоя - агаровую среду, предварительно засеянную соответствующим тест - микробом. Шесть стерильных цилиндров единого размера и массы, высоты и внутренним диаметром расставляют на поверхности засеянной среды на равном расстоянии друг от друга и от края чашки. В цилиндры или лунки каждой чашки вносят равные объемы рабочих растворов стандартного и испытуемого образцов. Основные растворы стандартных и испытуемых образцов готовят в стерильных растворителях с концентрацией 1 мг/мл. Затем из основных растворов в зависимости от применяемого варианта метода диффузии в агар (трехдозного или с построением стандартной кривой) готовят рабочие растворы трех или одной концентраций испытуемого образца и растворы трех или пяти концентраций стандартного образца. Диаметры ,зон угнетения роста тест - микроба при помощи соответствующих приборов измеряют с точностью до 0.1 мм.

Определение антимикробной активности антибиотиков с использованием трехдозного варианта меч ода лифф\ зии в агар.

Для проведения испытания готовят три раствора стандартного образца и три раствора испытуемого образца. Концентрации растворов, содержащих малую, среднюю и большую дозы, должны находиться между собой в кратном соотношении (1:2:4). При необходимости это соотношение может быть изменено. Все растворы стандартного и испытуемого образцов вносяч в цилиндры или лунки одной чашки Петри таким образом, чтобы растворы с большими концентрациями не соприкасались между собой. Число чашек, используемых в каждом опыте, должно быть достаточным для обеспечения статистической юстоверности результатов, но пс менее б'чашек/ Растет активности и дисперсионный аналиДфй йспбльзШании грехдозного варианта метода диффузии в агар осу ществляется в соответствии со статьей "Статистическая обработка результатов химического эксперимента и биологических испытаний" (ГФ XI. вып. I).. ГФ 12.

Определение антимикробной активности антибиотиков с использованием стан д арт но й кр и во й.

В день постановки анализа из основного раствора готовят пять рабочих растворов стандартного образца с концентрациями, увеличивающимися в геометрической прогрессии, обычно в соотношении 1:1,25. Средняя концентрация является контрольной. Для исследования растворов каждой концентрации (кроме контрольной) используют по три чашки. Раствор контрольной концентрации закапывают в три цилиндра (или лунки) каждой из взятых в опыт чашек, в три другие цилиндра (лунки) закапывают раствор одной из концентраций стандартного образца, чередуя его с раствором контрольной концентрации. Таким образом, для построения стандартной кривой используют 12 чашек. После инкубации в термостате измеряют диаметры зон угнетения роста тест - микробов. Далее вычисляют среднюю величину диаметров зон для раствора контрольной концентрации стандартного образца в каждой группе из трех чашек, затем среднюю величину диаметров зон для раствора контрольной концентрации стандартного образца из всех 12 чашек (общую среднюю из 36 зон). По разности между средней величиной зоны контрольной концентрации, установленной из 12 чашек, и средней величиной зоны контрольной концентрации, установленной из 3 чашек с каждой отдельной концентрацией, находят поправку к величине зоны данной концентрации. Найденную поправку прибавляют к средней величине диаметра зоны данной концентрации, если она положительная, и вычитают, если она отрицательная. Расчет антимикробной активности испытуемых образцов по стандартной кривой может быть проведен двумя способами: графическим методом или путем непосредственного расчета с использованием соответствующих формул. Для определения содержания активного вещества во флаконе активность, найденную в I mi . умножают на массу содержимого флакона, выраженную в миллиграммах. При исследовании раствора, приготовленного из всего содержимого флакона или ампулы, активность, найденную в I мл этого раствора, умножают на его объем. При необходимости определения содержания активного вещества в 1 мг испытуемого образца следует величину, характеризующую содержание активного вещества во флаконе, разделить на массу содержимого флакона, выраженную в миллиграммах.

Билет №13

6. Способность регенерации большого числа растений из массы неорганизованных тканей (каллусов), пролиферирующих in vitro, и из культур органов и пазушных почек чрезвычайно эффективной.

Растительные клетки и культура тканей основные объекты клеточной биологии, которая предоставляет возможности регенерации растений из протопластов, клеток и тканей, которые, в свою очередь, могут быть трансформированы или отобраны по специфическим генетическим признакам.

Культура растительных клеток позволяет быстро получать многочисленные популяции в управляемых и контролируемых условиях среды на ограниченном пространстве и идентифицировать линии растений с повышенной биологической ироду ктивностыо.

¹ Расти'тел мгые клетки мог} г культивироваться как lira-жилки*', так и твердых средах.

Растительные клетки но сравнению с клетками каллуса более гомогенны, быстрее растут и имеют более высокие адаптивные возможности. Культуры растительных клеток могут быть использованы для биотрансформации химических соединений и для эффективного синтеза биологически активных соединений de novo.

В культуре клеток не только сохраняется способность продуцировать биологически активные соединения, свойственные исходному растению, но и возникает способность синтезировать новые ценные продукты, не обнаруженные в соответствующих интактных растениях (перицин, перикалин, хинокиол. ферригинол, акуаммалин).

Возможно также получение мутантов с повышенными продукционными качествами. В настоящее время реализованы крупномасштабные культивационные системы растительных клеток для получения различных ценных веществ - ментола- женьшеня. убихинона-10. бетанина. камптотецина (антиканцероген), полипептидов ингибиторов фиговирусов, агар-агара и др.

Оптимизация процессов достигается путем использования иммобилизованных растительных клеток. Такие биологические системы более устойчивы к механическим повреждениям, при этом фаза роста клеток совпадает с фазой образования продукта: клетки легко переносятся в новую среду или иные культивационные условия.

Данная технология имеет существенные преимущества, так как позволяет быстро получать материал для размножения растений, включая системы, не содержащие возбудителей болезней, круглогодично иметь рассадочпый материал и повышать его однородность, длительно хранить генетический материал и создавать новые генотипы.