Посмотреть начало лекции!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
Методы детекции ПЦР
Аллель-цпецифичный ПЦР? Сайбер-грин не используется? Дорого. Надо проверять.
Современные методы детекции ПЦР в р.в.
универсальные интеркалирующие красители, так или иначе на основе Сайбр
Такман-зонды
Зонды с идеологией Бикон
Анализ SNP – лучше не использовать аллель-специфичный ПЦР, это рудимент прошлого. Анализ СНП хорошо с такман, а еще лучше Бикон. У последнего выше специфичность, и соответствеено точность.
Такман сильно выигрывает, когда нужно маленькие концентрации исходной мишени определять. А когда нужно точно разделять разные контексты, отличающиеся на одну букву, Бикман выигрывает
Микроскопом орехи не колят.
Гибридизационные зонды используют в мультиплексном анализе??????? Можно даже больше детектировать?????????????
Многих людей точность ПЦР не устраивает.
Проблема: до сих пор методы детекции недостаточно чувствительны, чтоб набрать нужное число точек на честной экспоненциальной фазе. Если бы можно было набрать 5-10 точек, то никаких проблем с точной реконструкцией начальной концентрации бы не было. Но, к сожалению, это невозможно. Работать приходится на фазе перегиба. Конечно, мы далеко ушли от фазы плато, что уже прогресс по сравнению с товарищами, которые использовали полуколичественный ПЦР и бромистый этидий.
На экзамен надо разобрать 2 подхода к полуколичественному ПЦР! Валидный невалидный эксперимент
К сожалению, ПЦР штука вообще мало воспроизводимая. Даже если мы раскапаем роботом, в разных пробирках у нас будет разный результат.
Давайте сделаем качественный ПЦР – двоичный индикатор: есть-нет.
А как оценить количество?
Возьмем исходную НК, и сделаем так, чтобы в единичный объем попадала одна молекула или вообще ни одной. Далее используем ПЦР как индикатор, что молекула там вообще была. С одной молекулы нарабатывается столько продукта, что мы его достоверно детектируем, что есть продукт– или нет вообще. Далее высчитываем, в скольки объемах НК была, а в скольки не было. А потом с помощью арифметики получаем точные концентрации.
Много статей. Российские товарищи тоже приложили конечности.
Чипы – умное слово, а обозначает просто очень маленькие ячейки пространства, где проводится ПЦР.
Пример.
В 96 луночном планшете. Роботизированная техника дозирования жидкостей. Использовали Бикон. На 2 аллельных варианта. Исследовали редкие мутации канцерогенного свойства, которые якобы возникают в опухоли. На 1 аллельный вариант – зеленый Бикон, на другой – красный. Соответственно, получили ПЦР-продукт. Используют Бикон извращенно: в конечной точке визуализуют продукт и определяют его аллельный вариант – фактически, им нужна конечная точка. Заканчивают ПЦР, потом гибридизуют Бикон и снимают результаты, смывая невключившиеся.
Потом концентрации аллельных вариантов определили очень точно.
Изначально разбавляли так, что вероятность попасть 2-м молекулам в ячейку была пренебрежимо мала
Русские – провели ПЦР в акриламидном геле, сильно разбавленном. Для этого даже сделали кустарный такой амплификатор, который представлял собой фактически утюг. Убрали часть, куда ставили пробирки, сделали ее круглой и гладкой и клали на нее гель.
Кстати, некоторые приборы для массового параллельного секвенирования работают так же. Похожи на вафельницу, а амплификация проходит в полиэтиленовыми мешочке. Такие мешочки зажимаются между 2-мя металлическими пластинами, и все.
Идея как выше описанное, только не нужны планшеты. Разбавляют исходную матрицу так, что там где в геле одна молекула, продукты там же и останутся, т.к. гель предотвращает диффузию, чтобы молекулы («колонии?») были на достатоточном расстоянии. Товарищи для детекции использовали авторадиографию. Были проблемы с получением большого количества продуктов, но это понятно, реакция в геле проходит хуже, фермент должен диффундировать сквозь поры в геле и т.д. После детекции по пальцам посчитали количество. Более эффетивносистема используется, без особых оптических методов.
Можно определять вирусную нагрузку при разных вирусных заболеваниях в крови, причем можно детектировать один вирус на фоне другого. Наличие другой, неспецифической НК не мешает детектировать.
Товарищи продвигали как клинический метод.
Масс-спектроскопия
Точное определение молекулярной массы БП – святой грааль для всех методов.
По данным скоростной седиментации не можем определит М, по данным изопикнической – можем.
По данным э/ф теоретически тоже можем.
Хроматография выбивается
Хотя гель фильтрация – для определения массы глобулярных белков. Можно по калибровочной кривой оценить массу
Но все эти методы были косвенными.
Иногда у нас длина одна, состав разный. И не все методы позволяют это понять.
Для определения чистоты вещества надо знать его массу.
Можно различить еще с использование электрофореза в градиенте денатурирующего агента – DGGE.
Хочется использовать прямые методы. Масс-спектрометрия – самый прямой. С точностью до 1 у.е.
Проблема – прикрутить метод для вещества с высокой молекулярной массой.
Как поступают с веществом, прежде чем подвергнут его МС?
Устройство самого простого прибора
Небольшая камера, где под действием электрического поля заданной величины, передается энергия заряженным частицам, строго известная. Энергия пропорциональна длине камеры, пропорциональна напряженности электрического поля и заряду частиц. Это работа силы Кулона на расстоянии длине расстояния разгонной камеры. Заряды при этом величиной 1. С зарядами >1 стараемся не работать. На детекторе частицу заригистрирует по изменению заряда на детекторе, по микроскопическому току, с регистраторами проблем нет, эта самая технически разработанная деталь. Время, в течение которого частица долетит до детектора, зависит от массы. Вся энергия силы Кулона превращается в кинетическую энергию частицы. По скорости реконструируем массу. Если, конечно, уверены, что заряд 1.
Масс-спектрометр способен анализировать только ионы, не нейтральные частицы
Масс-спектрометр измеряет отношение m/z, т.е. ион 1000++ будет зарегистрирован как 500+
Если заряд не 1, реконструируем в дискретном пространстве.
И наоборот, сли мы какие-то представления о масс имеем, можем реконструировать заряд.
Какие проблемы возникают, если мы пытаемся применить МС к крупным молекулам?
Вещество подвергают сублимации.
Один японец, инженер, получил Нобелевку за создание электроспрея.
Нам надо сделать так, чтобы молекула в какой-то момент оказалась в вакууме, не окруженная другими молекулами.
Жесткая ионизация не годится. Нагревание тоже. Подходит химическая ионизация.
Химическая ионизация при атмосферном давлении
Сначала молекула БП инкапсулируется в капельки растворителя, а потом растворитель удаляется за счет того, что постепенно капельки попадают в зону глубокого вакума, молекула в одиночестве. Проблема – заряда пока нет. Предлагается ионизовать в коронным разряде. Имеется большой напряженности эл поле никакого отношения к изменению траектории частицы оно иметь не будет (потому что пока заряда нет), и заряд просто переносится на этикапельки с помощью коронного разряда, есть надежда, что появится заряд, и БП попадает в зону детекции.
Пики очень тонкие. Очень высокая точность – до одного атома водорода.
Все равно жестко. В нижней части картины регистрации – продукты распада, куча пиков.
[если вдруг найдется пик ровно половинный от какого-то, то, возможно, 2-х зарядный ион?]
Основная масса побочных продуктов - возможно просто продукты деструкции. Плохо.
Возможно, такие продукты подойдут для реконструкции а/к состава белка, ведь по фрагментам тоже можно сделать выоды.
Для детекции по точным молекулярным массам веществ в смеси не подходит. Даже для смеси двух белков в таком заборе не разберемся.
Единственное, что ценно в той массспекрограмме, это последний пик, который позволяет оценить вес самого тяжелого компонента.
Более мягкий вариант - Электроспрей
Образец в жидкой фазе, распыляется, растворитель испаряется, все как в предыдущем опыте.
Жидкость подается по электроду, и заряд подается сразу, когда формируется капля на электроде. Напряжение подается такое, чтобы хотя бы один заряд на капле оставался. Похоже на детский опыт, потрем эбонитовой палочкой о шерстяную ткань.
Более щадящий метод, нет коронного разряда. Нет деструкции.
Как метод детекции и идентификации хорошо. Но не для всех веществ. Например, инертный устойчивый эритромицин сложнее ионизовать, но точная детекция.
Для пептидов где много аминогрупп – ионизация не контролируется (Трипсиноген). Ионизуются легко, но получаеся много заряженных аминогрупп. И никак не воспрепятствуем. По идее, можем подавать меньше напряжения – но тогда уровень ионизации вообще упадет до 0.
Снова возникают паразитные пики, но теперь их причина другая – кратная ионизация.
Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionisation Time-Of-Flight Mass Spectrometry (MALDI TOF MS)
Способ контролировать кратную ионизацию
Идея простая.
Вещество сокристаллизуется с матрицей, это обычно низкомолекулярное вещество.
Требования для вещества для матрицы:
Способствует правильной ионизации БП, причем для каждого класса БП матрицы свои.
Хорошо поглощает энергию лазера
При поглощении энергии в случае локального разогрева в-во сразу сублимируется
Для сублимации используется лазер
Если правильно подобрать матрицу все ОК.
Инкапсулируем БП в составе этой матрицы. Лазером быстро прогревается локально какой-то объем этой матрицы. Матрица сублимировалась, молекулы БП зависли в пространстве в вакууме. При этом матрица произвела ионизацию, засчет взаимодействия при высокой температуре в момент сублимации. В идеале – 1 заряд на молекулу.
Разные масс-спектрометры различаются только входами.