Хроматография

Хроматография является физико-химическим методом разделения, в процессе которого разделяемые компоненты распределяются между двумя фазами. Одна из этих фаз представляет собой стационарный слой с большой поверхностью (неподвижная фаза), а другая подвижна и фильтруется через слой неподвижной фазы.

Рождение хроматографии связано с именем русского ботаника Михаила Семеновича Цвета. С помощью хроматографии М. С. Цвет установил, что считавшийся однородным зеленый пигмент растений хлорофилл на самом деле состоит из нескольких веществ. При пропускании экстракта зеленого листа через колонку, заполненную порошком мела, и промывании бензолом он получил несколько окрашенных зон, что с несомненностью говорило о наличии в экстракте нескольких веществ. Впоследствии это было подтверждено другими исследователями. Этот метод он назвал хроматографией, что по-гречески означает запись цвета. Символично, что предложенное Цветом название метода, увековечило и фамилию самого изобретателя. Заметное развитие хроматографических методов началось в 30-е годы, когда возникла острая потребность в новом методе разделения смесей и очистки веществ, разлагающихся при нагревании. Хроматография продолжает бурно развиваться и в настоящее время является одним из наиболее перспективных методов анализа.

Хроматографию можно определить как процесс, основанный на многократном повторении актов сорбции и десорбции вещества при перемещении его в потоке подвижной фазы вдоль неподвижного сорбента. Вещество подвижной фазы непрерывно вступает в контакт с новыми участками сорбента и частью сорбируется, а сорбированное вещество контактирует со свежими порциями подвижной фазы и частично десорбируется.

1 Классификация методов хроматографии

Различные методы хроматографии можно классифицировать по агрегатному состоянию фаз, способу их относительного перемещения, механизму разделения, аппаратурному оформлению процесса и т.д.

1. Классификация по агрегатному состоянию фаз

Различают газовую и жидкостную хроматографию.

Газовая хроматография – подвижной фазой является газ (или пар). Варианты: газо-адсорбционная и газожидкостная. Газо-адсорбционная – неподвижная фаза – твердый адсорбент. Газожидкостная – неподвижная фаза – жидкость, а точнее пленка жидкости на поверхности частиц твердого сорбента. Жидкостная хроматография – подвижной фазой является жидкость. Жидко-жидкостная – неподвижная фаза – жидкость. Жидко-твердофазная – неподвижная фаза - твердый адсорбент. Жидко-гелевая включает хроматографию на сорбентах со структурой геля и ионообменную хроматографию.

1.2 Классификация по способу относительного перемещения фаз

Различают фронтальную, вытеснительную и проявительную (или элюэнтную) хроматографию.

Фронтальный метод. Это простейший по методике вариант хроматографии. Он заключается в непрерывном пропускании исследуемой смеси через слой сорбента. При этом на сорбенте образуются зоны, содержащие последовательно увеличивающееся число компонентов, а в конце анализа – порция, состав которой соответствует составу исходной смеси (рис.1.1). К достоинствам относится простота проведения опыта и отсутствие необходимости в элюэнте. К недостаткам: необходимость регенерации сорбента после каждого разделения; возможность получения в чистом виде лишь части первого компонента. Фронтальный метод используется сравнительно редко. Он применяется, например, при очистке раствора от примесей, если они сорбируются существенно лучше, чем основной компонент, или для выделения из смеси наиболее слабо сорбирующегося вещества.

а – кривые распределения концентрации разделяемых веществ на слое сорбента в колонке в зависимости от длины слоя; б – кривые распределения концентрации С на выходе из колонки в зависимости от объема V, пропущенного через колонку элюента (хроматограммы); А и В – разделяемые вещества; Е – растворитель; Д – вытеснитель

Рисунок 1.1 – Схематическое изображение протекания процесса при различных способах хроматографического разделения

Вытеснительный метод. Заключается в переносе разделяемой смеси потоком вещества (вытеснителя), сорбирующимся лучше любого из компонентов смеси. В ходе вытеснительного анализа образуются отдельные примыкающие друг к другу зоны компонентов, которые располагаются в порядке увеличения их сорбируемости (рис.1.1, б). Недостатком метода является необходимость регенерации сорбента, а также то, что зоны отдельных компонентов вплотную примыкают друг к другу.

Проявительный (элюентный) метод. Заключается в том, что сорбаты переносятся через сорбционный слой потоком вещества (элюента), сорбирующимся хуже любого из сорбатов. В ходе проявительного анализа разделенные компоненты анализируемой смеси выделяются из хроматографической колонки в потоке элюента отдельными зонами, в промежутках между которыми (при достаточно четком разделении) из колонки выходит чистый элюент. Процесс образования зон иллюстрируется рисунком (рис.1.1, в). Основные преимущества проявительного метода: 1) сорбент непрерывно регенерируется элюентом, поэтому после выхода наиболее сильно сорбирующегося компонента пробы немедленно может быть начато разделение следующей смеси; 2) при выборе соответствующих условий компоненты могут быть практически полностью изолированы друг от друга и будут находиться лишь в смеси с элюентом; 3) если концентрация исследуемого компонента соответствует линейному участку изотермы сорбции, время элюирования компонентов при заданных условиях является постоянной величиной, которая может быть использована для целей идентификации. Чем больше концентрация компонента, тем выше пик и больше его площадь, что составляет основу количественного хроматографического анализа. Проявительный метод дает возможность разделять сложные смеси, он наиболее часто применяется на практике. К недостаткам метода относятся необходимость использования значительных количеств элюента и уменьшение концентрации выходящих растворов за счет разбавления растворителем (газом носителем).

1.3 Классификация по механизму разделения

Адсорбционная хроматография – основана на различии в адсорбционном сродстве компонентов по отношению к активному твердому веществу.

Распределительная хроматография – основана на различии в растворимости (абсорбции) компонентов в неподвижной фазе (газо-жидкостная хроматография) или различием в растворимости (абсорбции, распределении) компонентов в подвижной и неподвижной фазах (жидко-жидкостная хроматография).

Ионообменная хроматография – определяется различием в ионообменном сродстве к неподвижной фазе.

Эксклюзионная хроматография – основана на эффекте исключения, обусловленная различием в размере и форме молекул (например, в хроматографии на молекулярных ситах) или в заряде (например, в хроматографии с исключением ионов). Термин гелевая эксклюзионная (ситовая) хроматография широко применяется для наименования такого процесса, в котором неподвижной фазой является набухший гель.

Хроматография, основанная на образовании соединения – основана на образовании (или диссоциации) молекулярных соединений в неподвижной фазе, например на образовании комплексов фермент-субстрат, антиген-антитело, олефин-нитрат серебра и реакции с хелатными смолами. А также образование осадка – осадочная хроматография.

1.4. Классификация по аппаратурному оформлению

1. Колоночная – отличается тем, что процесс проводят в насадочной или капиллярной колонке. Насадочную колонку заполняют сорбентом (насадкой). Внутреннюю стенку капиллярной колонки покрывают слоем жидкости или пылью адсорбента (либо пылью адсорбента или носителя, пропитанной жидкостью).

2. Плоскостная – осуществляется на плоскости. В хроматографии на бумаге – колонка заменена узкой полоской фильтровальной бумаги. В тонкослойной хроматографии на узкую стеклянную пластинку наносится тонкий слой тонко раздробленного адсорбента.

2 Хроматографический пик и элюционные характеристики

В хроматографии чаще всего используют методику проявительного (элюентного) анализа, при которой газ или раствор, выходящий из колонки, анализируется непрерывно. Типичная выходная кривая (хроматограмма) проявительного анализа приведена на рис. 2.1

Рисунок 2.1 – Выходная кривая проявительного анализа

Рисунок 2.2 – Кривая проявительного анализа (хроматографический пик)

Рассмотрим ее более подробно (рис. 2.2). Если точка А соответствует вводу анализируемой пробы, А – появлению на выходе какого-то несорбирующегося компонента, а В – появлению анализируемого вещества, то линию ААВ и ее продолжение ВF называют нулевой линией. Кривую ВDF называют хроматографическим пиком и характеризуют высотой, шириной и площадью. С удовлетворительной точностью контур пика описывается уравнением Гаусса :

, (1)

где V – объем подвижной фазы; V₀ – объем подвижной фазы, соответствующий с_max; _ст – стандартное отклонение, равное полуширине пика при .

Высотой пика считают либо величину h, либо h (см. рис. 2.2). Последняя равна расстоянию от нулевой линии до точки пересечения касательных к кривой в точках перегиба. Шириной пика называют расстояние между точками контура на половине его высоты (СЕ=_0,5) или на какой-то другой отметке по высоте, либо расстояние между точками перегиба (_п) или между точками пересечения нулевой линии с касательными к кривой в точках перегиба (ВF=_к=). Соотношения между этими величинами хорошо известны:

_0,5=2,36_ст, _п=0,85_0,5=2_ст; _к=1,700_0,5==4_ст. (2)

Важной хроматографической характеристикой системы является время удерживания или пропорциональный ему удерживаемый объем. На рис. приведенному удерживаемому объему соответствует отрезок AG, а общий удерживаемый объем характеризуется отрезком AG. Если длину отрезка AG обозначить l, то время удерживания t_r будет равно:

,

где w – скорость движения ленты самописца. Удерживаемый объем V_r пропорционален времени удерживания t_r:

V_r = t_r_r ,

Где  - объемная скорость газа-носителя. Приведенный удерживаемый объем , соответствующий отрезку АG, определяется отношением

,

где V₀ пропорционален отрезку АА, длина которого l₀. Величина V₀ характеризует удерживаемый объем несорбирующегося газа, или мертвей объем колонки. Приведенному удерживаемому объему соответствует приведенное время удерживания :

,

где t₀ пропорциональное величине l₀, характеризует время удерживания несорбирующегося газа. Произведение приведенного удерживаемого объема на коэффициент сжимаемости f называют эффективным удерживаемым объемом V_эф:

.

Коэффициент сжимаемости

,

где и - соответственно давление на входе в колонку и на выходе из нее. Важной характеристикой является абсолютный удельный удерживаемый объем V_m , рассчитываемый по формуле

, (3)

где m – масса адсорбента; Т_к – температура колонки.

Величина V_m не зависит от геометрических параметров колонки и может быть использована для качественной характеристики системы адсорбент – адсорбированный газ. Однако на эту величину существенное влияние оказывают случайные факторы. В значительно меньшей степени они влияют на относительный удерживаемый объем, равный отношению абсолютного удельного удерживаемого объема исследуемого вещества V_m,i к соответствующему объему вещества, принятого за стандарт, V_m,ст:

. (4)

Значения относительных удерживаемых объемов приводятся в справочных таблицах.

Полнота разделения двух компонентов количественно может быть выражена критерием разделения K:

, (5)

где l или V_r – расстояние между максимумами пиков разделяемых элементов; -полуширина хроматографического пика первого (1) и второго (2) компонентов на половине высоты, а нижний индекс «об» указывает на объемные единицы измерения. При K=1 разделение бывает достаточно полным. Если допустить, что ширина хроматографического пика обоих компонентов примерно одинакова, т.е. ₁_2, уравнение (5) принимает вид:

,

При взаимном перекрывании пиков определение ширины зоны каждого пика становится невозможным (рис. 2.3 ). В таких случаях рассматривают степень разделения 

, (6)

где h₂ – высота пика вещества, имеющего меньшую концентрацию; h_min – высота минимума.

Рисунок 2.3 – Определение степени разделения 

Значение тех или иных элюционных характеристик меняется в зависимости от цели анализа. В качественном анализе основное внимание уделяется определению характеристик удерживания и устранению искажений этих величин за счет второго компонента. В количественном анализе важно, чтобы четкость разделения обеспечивала достаточную точность определения площади или высоты хроматографического пика.