Оценка метаболической активности нейтрофилов в нст-тесте

Функцию нейтрофилов в антимикробной защите нередко оценивают в тесте по восстановлению нитросинего тетразолия (НСТ). Краситель НСТ попадает в фагосому где, после слияния с лизосомой, подвергается деградации под воздействием лизосомальных ферментов и активных форм кислорода с превращением в формазан. Гранулы формазана, в отличие от НСТ имеют синюю окраску. Тест дает возможность судить о фагоцитарной и метаболической функции гранулоцитов по образованию в цитоплазме гранул формазана.НСТ-тест имеет значение при инфекционных заболеваниях бактериальной этиологии, при гнойно-воспалительных процессах, злокачественных новообразованиях. Возможны спектрофотометрический и микроскопический варианты учета теста.Готовят раствор нитросинего тетразолия, для чего к навеске нитросинего тетразолия (НСТ) добавляют безводный диметилсульфоксид, нагревают до 50˚С и после остывания медленно добавляют раствор Хенкса (без Са²⁺ и Мg²⁺) до расчетного объема. Раствор готовят непосредственно перед использованием.

Исследование хемилюминесцентной способности клеток

В основе феномена клеточной хемилюминисценции фагоцитов лежит образование супероксидного анион-радикала в результате одноэлектронного восстановления молекулярного кислорода ферментной системой NADFH-оксидазой. Дальнейшие превращения этого радикала сопровождаются хемилюминисценцией. Хемилюминесцентный анализ позволяет выявлять первичные дефекты фагоцитоза. Например, при хронической гранулематозной болезни резко снижена (вплоть до полного отсутствия) хемилюминесценция, подавлен киллинг фагоцитированных микроорганизмов. С помощью хемилюминесцентного

анализа фагоцитов удается не только установить дефекты на уровне клеток, но и выявить дефекты опсонинов в сыворотке крови, в том числе индуцирующихся при активации комплемента по альтернативному пути, специфических антител. Хемилюминесценции фагоцитов возникает не только непосредственно при фагоцитозе частиц, но и уже при адгезии клеток, что дает возможность использования этого метода в процессе изучения кислородного метаболизма фагоцитов. Исследование проводят следующим образом:

1. Готовят 0,01% раствор люминола в растворе Хенкса без фенолового красного. Растворяют в течение 18 часов в темноте на магнитной мешалке. Конечная концентрация – 5,6 ×10^-4М.

2. Готовят раствор 1 (для снижения агрегации нейтрофилов). Все составляющие смешиваются и доводятся до 1 литра дистиллированной водой: NaCl – 8г.KCl – 0,4г, Na₂PO₄ – 0,4г, KH₂PO₄ – 0,4г, глюкоза – 1г, HEPES – 2,7г.

3. Готовят раствор 2: все составляющие смешиваются и доводятся до 100 мл раствором Хенкса: сывороточный альбумин –50 мкг , HEPES – 50 мкг, раствор люминола (5,6×10^-4М) – 200 мкл.

4. Готовят раствор зимозана – 20 мкг/мл.

5. В каждый флакон для сцинциляционного счета добавляют 2 мл раствора 2.

6. Во флаконы вносят суспензию нейтрофилов в растворе 1, так, чтобы конечная концентрация составила 0,5×10⁶ в мл.

7. Перемешивают содержание флаконов и помещают их в жидкостной сцинциляционный β-спектрометр, снабженный термостатируемым кюветным отделением.

8. Проводят измерение хемилюминесценции при 37ºС в 0,1 минутные интервалы на протяжении 90-120 минут.

9. В первый момент регистрации фиксируется фоновый показатель хемилюминесценции, за которым быстрое возрастание пика реакции. Этот показатель крайне низок и не учитывается в реакции, однако, если его значение превышает 0,06 имп/мин.клетка, он вычитается из пикового значения, по которому оценивается реакция. Обычно через 45-60 минут после начала измерения заканчивается адгезия клеток к стеклу, интенсивность хемилюминесценции приближается к фоновому уровню, в этот период во флаконы вносят суспензию зимозана в концентрации по 2 мг/мл 20 мкл (исходная суспензия 20 мг/мл разбавляется в 10 раз) и снова измеряют хемилюмесценцию, фиксируют число импульсов на протяжении 60 минут. Делают пересчет импульсов на клетку и выражают хемилюминесценцию условно в имп/мин клетка.