Генетическая инженерия прокариот

Клетки бактерий нашли широкое применение в биотехнологии. Методы генетической инженерии наиболее детально разработаны для микроорганизмов. В связи с этим появилась возможность более эффективно применять их многие полезные свойства. Используя генно-инженерные методы, можно конструировать микробные клетки, способные синтезировать продукты растительного и животного происхождения, имеющие большое значение для медицины и промышленности. Стало возможным превращать бактерии в своеобразные биологические «фабрики» по производству белковых препаратов, различных химических соединений, аминокислот и т. д.

Бактерии можно использовать как «фабрики» для синтеза белков и новых продуктов, изменяя метаболизм бактериальных клеток введением в них чужеродных генов или модификацией уже существующих; создавать рекомбинантные микроорганизмы, способные синтезировать самые разнообразные низкомолекулярные соединения: аскорбиновую кислоту, краситель индиго, аминокислоты, моноклональные антитела.

В современной биотехнологии широко используют трансгенные микроорганизмы, продуцирующие лекарственные препараты: антибиотики, гормоны, ферменты, витамины; различные препараты для диагностики наследственных и инфекционных заболеваний (например, ВИЧ, вирусного гепатита и др.); для производства незаменимых аминокислот, биодобавок, биополимеров (например, микробиологический синтез каучука), для биодеградации ксенобиотиков. С помощью трансгенных бактерий можно получать различного рода вакцины:

• субъединичные вакцины, содержащие отдельные компоненты патогенного организма; для их разработки используют технологии рекомбинантных ДНК;

• аттенуированные вакцины, содержащие непатогенные микроорганизмы, синтезирующие антигенные детерминанты определенного патогенного организма, либо штаммы патогенных микроорганизмов, у которых модифицированы или удалены гены вирулентности;

— «векторные вакцины», получаемые в большом количестве путем встраивания генов или их сегментов, кодирующих основные антигенные детерминанты патогенных организмов, в экспрессионные векторы. Продукт используют как вакцину.

Бактериальные клетки применяют также для клонирования необходимых для встраивания генов, проведения фундаментальных исследований и других целей.

В настоящее время бактерия Е. соli — самая изученная клетка из всех существующих. У большинства наиболее полно изученных фагов клеткой-хозяином является также Е. coli.

Генетическая инженерия животных Трансформация животного генома

Одними из носителей для введения чужеродной ДНК в животную клетку являются векторы на основе ДНК вирусов (например, SV40, вируса бычьей папилломы и т. д.) или на основе ретровирусов (например, на основе вируса лейкоза мышей). Они легко проникают в клетку хозяина, встраиваются в ее ДНК путем обычной инфекции и обеспечивают высокоэффективный перенос генов. В основном трансформации животных клеток осуществляют либо с помощью ретровирусов (около 40 % от всех трансформаций), либо путем упаковки ДНК в липосомы (25 %), реже используют другие способы.

Все генно-инженерные методы работы с клетками животных можно разделить на две группы: эксперименты с соматическими клетками и эксперименты по трансформации половых клеток. В последнем случае конечный результат — получение трансгенных организмов.

Генетическая трансформация соматических клеток животных

Культуры трансформированных клеток млекопитающих используют для получения различных веществ. Помимо создания клеток-продуцентов, трансформация соматических клеток млекопитающих позволяет изучать тонкие механизмы регуляции экспрессии генов и целенаправленно модифицировать генетический аппарат клетки животных, а при необходимости и человека, что имеет огромное значение для медицинской генетики.

Хотя культуры клеток животных при массовом выращивании гораздо менее экономичны, чем бактериальные и дрожжевые культуры, они обладают существенным преимуществом — способностью осуществлять мелкие, но весьма важные модификации белков — продуктов гена млекопитающих. Например, для эффективного функционирования ряда белков необходимо присоединение к ним цепочек из молекул углеводов или липидов. Образование и присоединение таких цепочек — обычный процесс для клеток млекопитающих, тогда как бактериальная клетка не способна производить подобные модификации.

Культуры клеток животных служат эффективным источником выделения некоторых вирусных антигенов с целью получения вакцин для животных и человека. Получение таких вакцинных культур клеток осуществимо с помощью техники рекомбинантных ДНК и эффективных векторов экспрессии для клеток млекопитающих и человека. При использовании ДНК-вакцин в организм вводится не антиген, а ген, кодирующий синтез этого антигена. Ген встраивается в плазмиду, плазмида вводится в организм путем обыкновенной инъекции, выработка вирусного белка провоцирует синтез специфических антител, т. е. вызывает иммунный ответ.

ДНК-вакцины имеют хорошие перспективы в животноводстве. Достоинством таких вакцин является маленький объем: для иммунизации одной мыши достаточно 10-50 мкг плазмиды, одной коровы — 200-300 мкг. Плазмида сохраняется в организме до одного года. В стадии клинических испытаний в настоящее время находятся ДНК-вакцины против микоплазм, возбудителя туберкулеза, сальмонеллеза, лейшманиоза.

Генетическая трансформация половых клеток животных

Если вводить ДНК в клетки многоклеточного организма, то результатом трансформации будет изменение свойств лишь небольшого числа клеток, которые приобрели новый ген. В этом случае животное будет химерным (т. е. клетки разных тканей будут иметь разный генотип).

Следовательно, для изменения свойств всего организма следует изменять геном половых клеток или зиготы, которые передадут новые свойства потомкам. Разработаны способы введения генов в эмбриональные клетки разных животных, в том числе млекопитающих и мух.

Существует две основные схемы создания трансгенных животных: микроинъекция чужеродной ДНК и введение генетической конструкции в эмбриональные стволовые клетки.

Микроинъекция чужеродной ДНК. Первая попытка была сделана американским ученым Дж. Гордоном в 1980 г. Методом микроинъекции он ввел в оплодотворенную яйцеклетку мыши рекомбинантную плазмиду pBR322, которая содержала ген тимидинкиназы вируса герпеса и фрагмент генома вируса SV40, вызывающего опухолевую трансформацию. В дальнейшем в геном мыши и других животных удалось ввести гены интерферонов, гормона роста человека и ряд других.

Микроинъекцию клонированных генов проводят в один или оба пронуклеуса только что оплодотворенной яйцеклетки мыши. Чаще выбирают мужской пронуклеус. После инъекции яйцеклетку немедленно имплантируют в яйцевод приемной (суррогатной) матери или дают ей возможность развиваться в культуре до стадии бластоцисты, после чего имплантируют в матку.

Для отбора трансгенных особей (несущих введенный ген) проводят молекулярно-генетический анализ родившегося потомства. Скрещивая трансгенных животных, можно получить чистые (гомозиготные) трансгенные линии.

Недостатком технологии создания трансгенных животных путем микроинъекции генетических конструкций в пронуклеус яйцеклетки является ее трудоемкость и мало-эффективность: полного развития достигает менее 1-5 % зигот.

Можно вводить ген в сперматозоиды и затем проводить ими оплодотворение. Таким образом были введены гены интерферона и инсулина человека, ген (3-глобина кролика, ген тимидинкиназы вируса простого герпеса и кДНК вируса лейкемии мышей.

Введение генетической конструкции в эмбриональные стволовые клетки (ЭСК). Впервые культивируемые линии ЭСК из бластоцист мыши были получены Эвансом, Кауфманом и Мартином в 1981 г. Позже аналогичные линии были получены из бластоцист других млекопитающих: золотистый хомячок (1988); свинья, овца (1990); корова, норка (1992); кролик (1993); крыса (1994); обезьяна (1995) и даже человек (1994).

Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) обычно получают из бластоцист. Когда число клеток (бластомер) эмбриона не превышает восьми, они являются недифференцированными, плюрипотентными (тотипотентными), т. е. способны дифференцироваться в любые типы клеток, включая клетки зародышевой линии, и каждая из них может дать начало новому организму. Эти клетки можно культивировать in vitro и после введения в них необходимого трансгена ввести в другой эмбрион на стадии бластоцисты, а затем имплантировать в матку суррогатной матери, производящей потомство. Скрещивая животных-основателей, несущих трансген в клетках зародышевой линии, можно получить линии трансгенных животных.

В отличие от предыдущего, этот метод позволяет проанализировать встраивание трансгена в геном клетки на стадии бластоцисты и проверить его экспрессию, что дает возможность выбрать линию ЭСК с наилучшими свойствами. Часть этих клеток можно заморозить в жидком азоте и хранить многие годы для последующего создания трансгенных животных.

Такой путь получения трансгенных животных выгоден еще и тем, что используются не зиготы, а бластоцисты. Их легко получить нехирургическим путем из половых путей самок крупных видов млекопитающих и трансплантировать суррогатным матерям для рождения трансгенных животных — основателей трансгенных линий.

Создание трансгенных животных — очень сложный и трудоемкий процесс. По статистике одно трансгенное животное удается получить на 40 инъецированных зигот мыши, на 100 зигот овцы или козы, на 1500 зигот коровы. К тому же это и неоднозначный процесс. Так как интеграция чужеродных генов носит случайный характер, могут быть повреждены соседние гены реципиента. Из трансгенных животных не более 50 % экспрессируют трансгенный белок, не у всех животных чужой ген попадает в половые клетки, т. е. способен передаваться потомству.