Определение нуклеотидной последовательности (секвенирование) днк
Секвенирование позволяет довольно быстро определить полную нуклеотидную последовательность ДНК длиной 100-500 нуклеотидных пар. Это необходимо для выяснения структуры, функций, возможностей рекомбинации и амплификации молекул или фрагментов молекул нуклеиновых кислот.
С помощью ферментов ДНК разделяют на фрагменты и определяют в них позиции нуклеотидов химическим или энзиматическим методом.
Химический метод был предложен в 1976 г. А. Максамом и У. Гилбертом. Он основан на химической деградации ДНК — специфической химической модификации пуриновых и пиримидиновых оснований с последующими выщеплением модифицированных нуклеотидов из цепи ДНК и анализом образовавшихся продуктов методом гель-электрофореза. Перед началом опыта один из концов фрагмента ДНК метят с помощью изотопа фосфора 32Р. Полученные электро-фореграммы проявляют с помощью рентгеновской пленки. Таким образом, фракционируя на одной гелевой пластине фрагменты, образовавшиеся после специфического выщепления каждого из четырех нуклеотидов (А, Т, Г и Ц), можно непосредственно читать нуклеотидную последовательность секвенируемой ДНК по проявленной электрофореграмме.
Энзиматический метод, разработанный М. Сэнгером, основан не на химическом, а на ферментативном подходе. Сэнгер использовал ДНК-полимеразу I. Анализируемый фрагмент ДНК используют в качестве матрицы в реакции полимеразного копирования (синтеза комплементарной цепи ДНК) с помощью ДНК-полимеразы I E. coli. Метод получил название «плюс-минус-метод», поскольку реакцию полимеризации в нем изначально проводили либо в отсутствие одного из четырех типов нуклеотидов («минус»-система), либо в присутствии только одного нуклеотида («плюс»-система), что ограничивает возможность наращивания полинуклеотидной цепи, т. е. останавливает (терминирует) ее синтез из-за недостатка соответствующего нуклеотида. Затем для остановки синтеза стали использовать специальные молекулы — терминаторы. Продукты реакций анализируют методом электрофореза, и секвенируемую последовательность считывают с радиоавтографа, так же как при анализе химического секвенирования.
В настоящее время определение точной нуклеотидной последовательности любого фрагмента ДНК вполне разрешимая задача. Уже определены последовательности не только сотен генов про- и эукариот, но и геномы многих организмов (более 800). Зная последовательность гена и генетический код, легко определить аминокислотную последовательность кодируемого им белка.
Конструирование фрагментов рекомбинантных ДНК («сшивка»)
Фрагменты рекомбинантных ДНК, полученные после действия рестриктаз и содержащие определенные гены, «сшивают» одним из трех основных методов, в зависимости от того, какие концы имеют фрагменты «сшиваемых» ДНК — «тупые» или «липкие».
«Сшивка» по одноименным «липким» концам. Это наиболее простой и популярный метод. Впервые этим методом гибридная ДНК была получена С. Коэном с сотрудниками в 1973 г. Любые два фрагмента ДНК (независимо от их происхождения), образовавшиеся под действием одной и той же рестриктазы, дающей фрагменты рестрикции с «липкими» концами, могут «слипаться» за счет образования водородных связей между однонитиевыми участками комплементарных нуклеотидов. Однако после такого спаривания полная целостность двойной спирали не восстановится, поскольку останется два разрыва в фосфодиэфирном остове. Для его восстановления, т. е. «сшивания», или лигирования, нитей, используют ДНК-лигазу бактериофага Т4. Этот фермент в живой клетке выполняет ту же функцию: «сшивание» фрагментов ДНК, синтезирующихся при репликации.
«Сшивка» по «тупым» концам. «Тупые» концы можно соединять за счет действия ДНК-лигазы. В этом случае реакция лигирования имеет свои особенности и ее эффективность ниже, чем при «сшивке» по «липким» концам. Впервые такие эксперименты были выполнены в 1972 г. П. Бергом в Стэнфордском университете (США). В частности, этот метод, используют при клонировании ДНК-копий матричных РНК, которые доступны в ограниченных количествах. «Сшивка» фрагментов с разноименными концами. В ситуации, когда необходимо «сшить» фрагменты, образованные разными эндонуклеазами рестрикции и имеющие разные, т. е. некомплементарные друг другу, «липкие» концы, применяют так называемые линкеры (или «переходники»). Линкеры — это химически синтезированные олигонуклеотиды, представляющие собой сайты рестрикции или их комбинацию. Впервые эту идею предложил Г. Шеллер с сотрудниками в 1977 г. Существуют большие наборы таких генных «переходников». «Липкие» концы также можно ферментативным путем присоединить к молекулам ДНК с «тупыми» концами. При этом первоначально «достраивают» недостающие фрагменты, чтобы образовались комплементарные «липкие» концы. Далее для ковалентного соединения двух фрагментов используют ДНК-лигазу. Поскольку можно формировать достаточно длинные взаимно-комплементарные одноцепочечные концы, гибридные молекулы образуются с высокой эффективностью.