Год: 

2008

Автор: 

Гришанин, Андрей Константинович

Ученая cтепень: 

доктор биологических наук

Место защиты диссертации: 

Москва

Код cпециальности ВАК: 

03.00.15

Специальность: 

Генетика

Количество cтраниц: 

142

Оглавление: 

1 ВВЕДЕНИЕ.

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1 Парадокс размера генома эукариот.

2.2 Феномен диминуции хроматина у копепод (Copepoda, Crustacea). 2.3 Диминуция хроматина у пресноводных копепод (Cyclopoida, Copepoda,

Crustacea).

2.3.1 Ранний эмбриогенез и диминуция хроматина.

2.3.2 Структура хромосом и диминуция хроматина.

2.3.3 Количественные характеристики геномов пресноводных копепод.

2.3.4 Механизм диминуции хроматина у пресноводных копепод.

2.4 Особенности диминуции хроматина у других видов многоклеточных животных.

2.4.1 Диминуция хроматина у нематод.

2.4.2 Элиминация хромосом у двукрылых.

2.4.3 Диминуция хроматина у миксин.

2.5 Диминуция хроматина при созревании вегетативных ядер (макронуклеусов) у инфузорий.

2.6 Биологическая роль диминуции хроматина.

3 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

4 РЕЗУЛЬТАТЫ.

4.1 Содержание ядерной ДНК в клетках исследованных видов пресноводных копепод.

4.2 Временные аспекты ДХ и особенности раннего эмбрионального развития у исследованных видов пресноводных копепод.

4.3 Структура интерфазного ядра у исследованных видов пресноводных копепод до и после ДХ.

4.4 Хромосомы исследованных видов пресноводных копепод.

4.4.1 Хромосомные числа и размеры хромосом.

4.4.2 Особенности структурной организации митотических хромосом.

4.5 Полиплоидные клетки.

4.6 Структура последовательностей ДНК, элиминируемых в процессе диминуции хроматина у особей московской популяции Cyclops kolensis. .85 4.7 Особенности радиационного мутагенеза у Cyclops kolensis и Cyclops гаг^ш,?.

4.8 Цитогенетическое исследование популяций некоторых видов пресноводных копепод.

4.9 Биологическая роль и механизм диминуции хроматина у пресноводных копепод.

4.10 Парадокс размера генома эукариот с позиции данных, полученных при исследовании ДХ у пресноводных копепод.

Введение: 

Актуальность проблемы. Диминуция хроматина - общее название клеточных генетических процессов, в ходе которых соматические клетки многоклеточных животных или соматические ядра простейших теряют большую или меньшую часть генетического материала, присутствующего в клетках зародышевой линии многоклеточных животных или в генеративных ядрах простейших.

Диминуция хроматина (ДХ), открытая более 100 лет тому назад Т. Бовери [Воуеп, 1887], остается и до сих пор мало изученным феноменом. У абсолютного большинства видов животных ДХ отсутствует, а размеры геномов соматических клеток и клеток зародышевой линии совпадают. Среди эукариот ДХ обнаружена всего у нескольких десятков видов среди простейших, нематод, насекомых, миксин, пресноводных ракообразных. К началу наших исследований данные о механизмах ДХ у пресноводных ракообразных и самом этом феномене были фрагментарными. Ни у одной из групп животных, у которых наблюдается ДХ, не была изучена ультраструктура хромосом и интерфазных ядер в соматических клетках до и после ДХ. Ничего не было известно об ультраструктуре гранул элиминируемого хроматина и о ДНК, заключенной в эти гранулы. Было неясно, зачем немногим видам животных нужна ДХ. До нашей работы не была отмечена связь между ДХ и так называемым парадоксом размера генома эукариот, отсутствием прямой зависимости между сложностью организации вида и величиной генома по массе ДНК; отсутствовали исследования по внутривидовой вариабельности цитогенетических признаков у пресноводных ракообразных. Актуальность изучения ДХ также определяется значимостью для биологии развития инактивации генов в онтогенезе.

Исследование ДХ, по нашему мнению, может внести значительный вклад в решение одной из основных проблем биологии: парадокса размера генома эукариот, или С-парадокса. Уникальным объектом для решения этой задачи, по-нашему мнению, могут стать виды пресноводных ракообразных с наибольшей долей элиминируемой ДНК в результате диминуции хроматина. С позиций общих представлений о роли объектов в истории биологии, и генетики в особенности, это очень важно. Именно подходящие объекты, которые, как правило, составляют ничтожную долю биоты, дают возможность открыть новые пути, а иногда даже новые направления исследований [Gregory, Hebert, 1999; Gregory, 2001; Hedges, 2002].

Цель работы и задачи исследования

Цель диссертационной работы состоит в изучении механизма диминуции хроматина, ее эволюционного значения и поиске новых подходов к решению проблемы парадокса размера генома эукариот.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать процесс диминуции хроматина методами цитогенетики, цитофотометрии и электронной микроскопии.

2. Изучить структуру последовательностей ДНК, элиминируемых в процессе диминуции хроматина.

3. Определить частоту аберраций хромосом у видов с близкими величинами геномов и равным диплоидным числом хромосом, но различающихся по наличию диминуции хроматина в раннем эмбриогенезе.

4. Выявить цитогенетические характеристики ряда видов циклопов.

Научная новизна

1. Диминуция хроматина (ДХ) впервые обнаружена и исследована у пресноводных ракообразных Cyclops kolensis и Paracyclops affinis. Обнаружен подвид Cyclops strenuus strenuus, диплоидное количество хромосом у которого, а также картина и график диминуционных процессов отличаются от описанных ранее для вида Cyclops strenuus Берман. У видов Acanthocyclops viridis, Macrocyclops albidus, Eucyclops serrulatus,

Termocyclops crassus, Cyclops ins ignis, Acanthocyclops vernalis ДХ не выявлена.

2. Обнаружена и описана мембрана, окружающая элиминируемый хроматин.

3. Обнаружены высокополиплоидные ядра у некоторых видов циклопов.

4. Из гранул элиминируемого в ходе ДХ хроматина выделена ДНК и выявлены признаки упорядоченности ее структуры: мозаичная организация повторяющихся последовательностей, высокий консерватизм повторов ДЕК, сохраняющихся в поколениях только в клетках зародышевой линии.

5. Показан высокий уровень консервативности элиминируемой фракции генома.

6. Выявлены значительные отличия в радиочувствительности до- и последиминуционных хромосом.

7. Обнаружены внутривидовые отличия у ряда видов Cyclopoida по отдельным цитогенетическим характеристикам: диплоидное число хромосом, величина генома, наличие или отсутствие ДХ и ее особенности.

Научно-практическая значимость исследования заключается в использовании для таксономии отряда Cyclopoida таких цитогенетических характеристик как: наличие или отсутствие ДХ, количество ядерной ДНК в клетках зародышевой и соматической линии, хронология процесса ДХ, распределение гранул элиминируемого хроматина в анафазе диминуционного деления. Результаты и выводы, сделанные при обсуждении данного исследования, могут использоваться в курсах лекций по зоологии беспозвоночных и общей генетике.

Публикации. Основные результаты исследований, представленные в диссертационной работе, изложены в 22 статьях, опубликованных в рецензируемых российских и зарубежных журналах, из них 17 опубликованы в журналах, рекомендованных ВАК.

Апробация работы. Основные материалы диссертационной работы были доложены на научных семинарах и на заседании Ученого совета Института биологии внутренних вод им. И.Д. Папанина РАН (1991-1995), на научных семинарах Института химической физики им. H.H. Семенова РАН (1991-1993), Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН (1994), Института молекулярной генетики РАН (1995), Института цитологии РАН (1994); на заседании Санкт-Петербургского отделения ВОГиС, посвященном 90-летию со дня рождения A.A. Прокофьевой-Бельговской (30 марта 1993); на международной конференции "Эволюционная генетика и адаптация", посвященной памяти Жака Моно (Оссуа, Франция, 25-29 сентября 1995), на III Съезде ВОГиС «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития» (Москва, 6-12 июня 2004), на III Международной конференции «Вид и видообразование» (Томск, Томский государственный университет, 2004), на III Международной конференции "Генетические последствия чрезвычайных радиационных ситуаций" (Россия, Дубна, 4-7 октября 2005), на IY Международной конференции по кариосистематике беспозвоночных животных (Россия, Санкт-Петербург, 28-30 августа 2006).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования, их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Текст диссертации изложен на 142 страницах машинописного текста и содержит 19 таблиц и 41 рисунок. Список литературы включает 187 источников.

Заключение: 

6 ВЫВОДЫ

1. Обнаружен и исследован механизм диминуции хроматина у Cyclops kolensis и Paracyclops affinis. У ряда видов циклопов выявлены высокополиплоидные клетки. Высказано положение о том, что процесс ДХ представляет собой альтернативную форму регуляции клеточной дифференцировки на соматическую и зародышевую линию, во время которой происходит полная потеря избыточной части генома; в то время как у подавляющей части эукариот эта часть генома инактивируется путем гетерохроматинизации.

2. Установлено изменение ультраструктуры интерфазных ядер клеток соматической линии у С. kolensis в результате ДХ, связанное с появлением компактизованного хроматина, но не найдено принципиальных различий в структуре хромосом клеток соматической линии до и после ДХ. В гранулах элиминируемого хроматина у С. kolensis обнаружена плотная лишенная пор мембрана.

3. Показано, что последовательности ДНК из гранул элиминируемого хроматина являются АТ-богатыми и локализованы во всех додиминуционных хромосомах. Среди фрагментов элиминируемой ДНК обнаружены семейства повторов с высоким уровнем гомологии внутри семейств. Один из фрагментов элиминируемой ДНК московской популяции С. kolensis присутствует в додиминуционном геноме байкальской популяции С. kolensis и является высококонсервативным. Данный повтор не полностью элиминируется во время ДХ, его копии присутствуют в геноме соматических клеток взрослых циклопов как московской, так и байкальской популяций.

4. Определено, что частота аберраций хромосом в клетках зародышей С. kolensis до ДХ превышает таковой показатель для клеток соматической линии зародышей С. kolensis после ДХ более чем в 50 раз. Частота аберраций хромосом в клетках зародышей С. ins ignis (вида без ДХ) не изменяется в ходе эмбриогенеза.

5. Выявлена внутривидовая изменчивость у Cyclops kolensis, С. s. strenuus, С. insignis, Termocyclops crassus и Acanthocyclops vernalis no следующим признакам: диплоидное число хромосом, величина генома, картина и хронология диминуционных процессов. Показано, что наличие ДХ в онтогенезе у циклопов не связано с величиной генома. Высказана гипотеза, что процесс ДХ является механизмом генетической изоляции между криптическими видами, у одного из которых ДХ отсутствует.

6. При исследовании различных популяций вида Acanthocyclops vernalis установлена: а) изменчивость диплоидного числа хромосом при неизменной величине генома; б) полная репродуктивная изоляция всех изолиний самок, полученных из разных водоемов, и двух изолиний самок, полученных из одного водоема, независимо от диплоидного числа хромосом; в) частичная репродуктивная изоляция двух изолиний самок, полученных из одного водоема и обладающих разным диплоидным числом хромосом.

7. На основании полученных результатов предложено рассматривать ДНК, элиминируемую у С. kolensis в результате диминуции хроматина, как избыточную для клеток соматической линии. Высказано предположение, что элиминируемая в ходе диминуции ДНК не несет значительных кодирующих и регуляторных функций, так как ее отсутствие в клетках сомы не препятствует нормальному ходу онтогенеза, а сам процесс диминуции хроматина появился как механизм генетической изоляции между видами-двойниками.

Работа была поддержана грантами РФФИ и грантом РАН «Генетические аспекты эволюции биосферы».

5 ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В работе проведено комплексное исследование процесса диминуции хроматина методами цитогенетики, цитохимии, молекулярной генетики и электронной микроскопии. Обнаруженные факты наличия ДХ у С. ко\етг5, во время которой из хромосом пресоматических клеток удаляется 94% ДНК, при сохранении диплоидного числа хромосом после ДХ, позволяют рассматривать элиминируемую ДНК как избыточную для клеток соматической линии, так как отсутствие в них этой части генома не препятствует нормальному ходу онтогененеза. В то же время редукция 94% генома клеток соматической линии С. коЫтгз в результате ДХ позволяет утверждать, что элиминируемая ДНК не несет никаких значительных кодирующих и регуляторных функций. Выявленные признаки упорядоченности в структуре избыточной ДНК у С. ко1ет1з\ мозаичная организация повторяющихся последовательностей, высокий консерватизм повторов ДНК, сохраняющихся в поколениях только в клетках зародышевой линии, позволяют отказаться от использования по отношению к избыточной ДНК таких терминов, как "паразитическая", "эгоистическая", "мусорная" ДНК. Факт сохранения после ДХ полноразмерного генома в клетках зародышевой линии разрешает предположить, что последовательности, удаляемые в процессе ДХ из клеток соматической линии, необходимы для нормального хода мейоза и созревания половых клеток, а сам процесс ДХ представляет собой механизм генетической изоляции между критическими видами, у одного из которых ДХ отсутствует.

Результаты, полученные при помощи световой и электронной микроскопии, показывают, что процесс ДХ представляет собой альтернативную форму регуляции клеточной дифференцировки на соматическую и зародышевую линии, во время которой происходит полная потеря избыточной части генома, в то время как у подавляющей части эукариот избыточная часть генома инактивируется путем гетерохроматинизации.

Исследован механизм ДХ у циклопов. Результаты, полученные методами количественной цитофотометрии, показывают, что причина появления ДХ в онтогенезе не связана с необходимостью удаления из генома соматических клеток избыточной ДНК.

Данные, полученные нами при изучении видов Cyclopoida методами цитогенетики, показывают значительную вариабельность цитогенетических признаков у популяций изученных видов пресноводных копепод, что позволило высказать предпол

Год: 

2006

Автор: 

Комкова, Галина Викторовна

Ученая cтепень: 

кандидат биологических наук

Место защиты диссертации: 

Курск

Код cпециальности ВАК: 

03.00.15

Специальность: 

Генетика

Количество cтраниц: 

194

Оглавление: 

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. Литературный обзор.

1.1. Особенности гетерохроматиновых районов хромосом.

1.1.1. Генетические и цитологические характеристики хромосом.

1.1.2. Молекулярные характеристики гетерохроматина.

1.1.3. Эволюция гетерохроматина.

1.1.4. Исследования гетерохроматиновых районов.

1.2. Полиморфизм гетерохроматина человека.

1.2.1. Характеристика С-гетерохроматина у человека.

1.2.2. Полиморфизм гетерохроматина в нормальной популяции.

1.2.3. Хромосомный полиморфизм в пренатальный период развития человека.

1.2.4. Хромосомный полиморфизм в постнатальный период развития человека.

1.2.5. Вариабельность морфофизиологических признаков и возрастная изменчивость гетерохроматина.

Глава 2. Материалы и методы исследования

2.1. Характеристика изучаемой выборки.

2.2. Методы исследования.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Глава 3. Общая характеристика с-гетерохроматина в курской популяции и сравнительный

АНАЛИЗ ЕГО ПОЛИМОРФНЫХ ВАРИАНТОВ.

3.1. Количественная оценка С-гетерохроматина среди жителей

Курской области и сравнительный анализ его полиморфизма. 39 щ 3.2. Многомерный анализ полиморфных вариантов С-гетерохро-матина у жителей Курской области и его сравнительная оценка.

3.3. Обсуждение.

Глава 4. Гомо- и гетероморфизм объемов с-гетерохроматина среди жителей курской популяции.

4.1. Сравнительный анализ распространенности гомо- и гетероморфных объемов С-гетерохроматина.

4.2. Сравнительный анализ по двум и трем парам гомо- и гетероморфных сочетаний С-сегментов в кариотипе.

4.3. Многомерный анализ количественной представительности С-гетерохроматиновых блоков по одной паре хромосом (по 1,

4> 9,16 парам хромосом).

4.4. Многомерный анализ количественной представительности гомоморфных С-гетерохроматиновых блоков по двум парам хромосом (1 и 9; 1 и 16; 9 и 16).

4.5. Многомерный анализ количественной представительности

С-гетерохроматиновых блоков по трем парам хромосом

1,9,16).

4.6. Обсуждение.

Глава 5. Полиморфизм объема с-гетерохрома-тина у жителей курской области в разные возрастные периоды.

5.1. Стандартная статистика С-гетерохроматина и возрастная характеристика исследуемой выборки.

5.2. Многомерный анализ вариабельности объема С-гетерохроматина в разные возрастные периоды у жителей Курской популяции и оценка взаимосвязи объема С-гетерохроматина у мужчин и женщин с возрастом.

5.3. Обсуждение.

Глава 6. Изучение влияния изоляции расстоянием между местами рождения родителей, бабушек -дедушек на с-полиморфизм 1, 9, 16 и y ' хромосом у жителей курской области и оценка их взаимосвязей.

6.1. Сравнительная характеристика С-гетерохроматина и изоляции расстоянием между местами рождения супругов.

6.2. Многомерный анализ изоляции расстоянием между местами рождения супругов двух поколений и полиморфизм объемов С-гетерохроматина исследуемых хромосом у пробандов.

6.3. Обсуждение.

Введение: 

Современная цитогенетика человека является интенсивно развивающейся областью, играющей все более возрастающее значение в клинической медицине. Работами многочисленных исследователей установлена тесная связь между изменчивостью количества и структуры хромосом в наборе и патологиями человека. Хромосомному анализу сегодня отводится важная роль в дифференциальной диагностике врожденных пороков развития, бесплодия, невынашивания беременности, нарушения полового развития и умственной отсталости, эндокринных и гематологических заболеваний, отдельных форм злокачественных новообразований.

Исследование структурно-функциональной организации эукариот является одной из центральных задач современной генетики. В настоящее время, когда геном человека практически полностью сиквенирован, все большее внимание стало уделяться функциональной геномике, в задачи которой входит изучение функций индивидуальных хромосом и их отдельных сегментов в организме человека. Основным фактором широкой структурной изменчивости полиморфизма хромосом человека и всех эукариотических организмов являются гетерохроматиновые районы, которые эволюционно закреплены в структуре наследственного вещества всех эукариотических организмов - растений, животных и человека. У различных видов они составляют от 10 до 60% всего генома. У человека они составляют 16% [97].

Гетерохроматин, представляющий собой высококопийные тандемные повторы различного нуклеотидного состава и протяженности, - одна из наиболее загадочных структур хромосом [84, 97].

Несмотря на многочисленные исследования с использованием различных биохимических, молекулярных и цитогенетических методов, биологическая роль хромосомного полиморфизма, в том числе и его функциональная значимость в индивидуальном развитии организма, остаются неясными [84, 100, 101].

Разработанные методы дифференциального окрашивания позволили безошибочно выявлять С-гетерохроматин в хромосомах человека и исследовать его особенности [43].

Кроме фундаментальных работ по организации гетерохроматиновых районов на молекулярном, субмикроскопическом и микроскопическом уровнях, их локализации в хромосомах человека, имеются сообщения о вовлеченнности околоцентромерного гетерохроматина в этиологию спонтанных абортов, невынашивания беременности, дефектов развития и т.д. [92, 93, 96, 110, 111]. Проблема гетерохроматина стала приобретать не только теоретическое, но и медико-генетическое значение.

Современный период характеризуется активным развитием феногенети-ки, которая, возможно, ответит на такие вопросы как: каким образом молеку-лярно-генетические события в ходе онтогенеза детерминируют формообразовательные процессы? Как из молекулярных изменений складываются изменения морфогенетические? Особую значимость в решении этих проблем приобретет расшифровка структуры гетерохроматина и его функций.

На сегодняшний день высказывается мнение о том, что в гетерохромати-не локализованы гены - регуляторы пролиферации и клеточного роста, необходимые для нормального развития, а также факторы их регуляции. При этом активация и инактивация осуществляются путем изменения характера метилирования [20, 38, 84, 128].

Несмотря на то, что вопрос о полиморфизме гетерохроматина обсуждается в литературе давно, он и сегодня не может считаться окончательно решенным. Для популяции человека характерен широкий полиморфизм гетерохроматина как в индивидуальном кариотипе, так и между гомологами хромосомной пары. Возникает ряд вопросов: Что стоит за локализацией гетерохроматина в определенных хромосомах? Случайно это или закономерно? Отсутствует исчерпывающая информация по гомо- и гетероморфизму гомологов как по паре хромосом, так и в различных сочетаниях. Остаются открытыми вопросы: количественных характеристик гетерохроматина; его суммарной оценки; происходит ли селективный отбор в популяции по содержанию наиболее оптимального количества гетерохроматина в клетке. Не получила должного освещения проблема адаптивной роли гетерохроматина, влияния изоляции расстоянием на количественную представительность гетерохроматина в геноме. Последовательное прохождение различных фаз пре-, анте- и постнатального периодов онтогенеза - рост, созревание и старение - связано с выполнением генетической программы развития. Ответить на вопросы, связана ли эта программа с изменением полиморфных районов хромосом можно при анализе частотных характеристик данных участков хромосом в разных возрастных группах лиц из нормальных популяций. Противоречивые данные по данному вопросу в литературе диктуют потребность дальнейшего углубленного анализа этой проблемы [62, 78, 103].

Встречающиеся в литературе работы с использованием разных методов оценки С-гетерохроматина (количественные, полуколичественные) вызывают значительные трудности объективного анализа степени полиморфизма. Поэтому полученные собственные результаты могут быть использованы в качестве цитогенетического показателя в практике медико-генетического консультирования. Традиционный полуколичественный метод оценки С-гетерохроматина в практическом здравоохранении является достаточно доступным, в сравнении с молекулярно-генетическими методами, которые в силу своей дороговизны и технологичности для массовых исследований пока являются малодоступными. Вышеизложенное определило наш выбор на полуколичественном методе С-окраски, получившем распространение при изучении различных популяций. Таким образом, дальнейшее изучение С-гетерохроматина у человека отражает объективную потребность дальнейшего углубления и развития представлений не только о его полиморфизме, но и роли в организации и функционировании наследственного материала.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ:

Оценить полиморфизм С-гетерохроматина у жителей Курской области, провести многомерный анализ выраженности и взаимосвязанности его объемов в кариотипах с учетом возраста индивидуумов и изоляции расстоянием между местами рождения родителей пробандов.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1 .Проанализировать распространенность С-сегментов гетерохроматина и характер хромосомного полиморфизма среди жителей Курской области.

2. Изучить закономерности вариабельности и взаимосвязей между объемами С-гетерохроматина в геноме человека.

3. Исследовать закономерности проявления гомо- и гетероморфизма С-сегментов гетерохроматина в исследуемых кариотипах.

4. Оценить количественную представленность С-гетерохроматина в различных возрастных группах в популяции.

5. Рассмотреть влияние изоляции расстоянием между местами рождения супругов F] и F2 поколений на количественную представленность и распространенность С- гетерохроматина в исследуемой выборке пробандов.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА Впервые определена распространенность С-сегментов гетерохроматина 1, 9, 16, Y хромосом (в баллах) у жителей Курской области, установлен модальный класс для каждой пары хромосом. Предложено понятие «суммарного гетерохроматина» и определены адаптивные границы по этой величине. Проведена оценка объемов С-гетерохроматина среди жителей Курской области. Установлено смещение наблюдавшихся балльных сочетаний в сторону преобладания некоторых С-вариантов по сравнению с теоретически ожидаемыми. Изучен гомо- и гетероморфизм по каждой паре анализируемых хромосом, а также рассмотрены их возможные сочетания, установлена их взаимосвязь в геноме. Впервые изучено влияние изоляции расстоянием на количественную представленность С-гетерохроматина в популяции. Установлены достоверные отличия объемов С-сегментов исследуемых хромосом в разных возрастных группах у мужчин и женщин. Показано уменьшение С-сегментов 1,9, 16 хромосом с возрастом.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ

Полученные новые знания, расширяющие представление о полиморфизме С-гетерохроматина в геноме человека. Показатель «суммарный гетерохрома-тин» рекомендован для введения в качестве одной из характеристик при выполнении цитогенетических анализов кариотипов в практическом здравоохранении. Полученные величины по суммарному гетерохроматину могут быть использованы в качестве показателей нормы в практике медико-генетического консультирования. Полученные результаты открывают перспективы прогнозирования объемов С-гетерохроматина с учетом возраста пробандов и изоляции расстоянием между местами рождения супругов Fi и F2 поколений.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Для Курской популяции, как и для других в РФ, характерен полиморфизм С-сегментов гетерохроматина. Однако их частота и распространенность имеет свои региональные особенности. Установлены статистически значимые взаимосвязи между объемами С-сегментов отдельных хромосом в геноме.

2. Фактически наблюдаемый полиморфизм С-сегментов в популяции статистически значимо отличается от теоретически ожидаемого, что указывает на проявление самостоятельных механизмов формирующих этот полиморфизм.

3. Вариабельность объемов С-гетерохроматина среди жителей Курского региона на геном находится в пределах от 6 до 23 баллов. Адаптивная средняя норма для популяции ( Х±а) составила 12-18 баллов и наблюдалась у 75,4% обследуемых. Лица, имеющие объемы гетерохроматина ниже (6-11 баллов) и выше адаптивной средней (19-23 балла), имели по 12,3%. У обследуемых, объемы гетерохроматина которых выходили за пределы адаптивной средней, наблюдалась выраженная дезинтеграция корреляционных взаимосвязей между С-сег-ментами.

4. Полиморфизм С-гетерохроматина формируется через гомо- и гетероморфизм, при этом сопряженность взаимосвязей между объемами С-сегментов наиболее выраженно проявлялась у гомоморфов.

5. Между различными возрастными группами популяции наблюдаются статистически значимые различия по суммарному объему гетерохроматина. При этом среди мужского населения в возрасте 51-60 лет, женского 61-70 лет наблюдается увеличение его объемов.

6. Изоляция через расстояние между местами рождения родителей оказывает статистически значимое влияние на объемы С-гетерохроматина в геномах обследованных пробандов.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ И ПУБЛИКАЦИИ

Материалы диссертационной работы представлялись на итоговых научных сессиях КГМУ (Курск, 2002, 2003, 2004); межвузовской научной конференции молодых ученых (Курск, 2004 г.; Екатеринбург, 2003 г.; Самара, 2004 г.); международной Тихоокеанской научно-практической конференции (Владивосток, 2003, 2004); в журнале «Человек и его здоровье» (Курск, 2003 г.); в сборнике «Передовые технологии науки и образования» (Курск, 2004); IV Вавилов-ском съезде ВОГиС ( Москва, 2004); региональной конференции «Современные вопросы медицинской науки и практики» (Курск, 2005); конференции «Современные направления теоретической и практической медицины» (Воронеж, 2005); V съезде российского общества медицинских генетиков (Уфа, 2005); научной конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы медицины и биологии» (Тунис, 2005). По материалам диссертации опубликовано 16 работ.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация изложена на 148 страницах машинописного текста и включает разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, 4 главы результатов собственных исследований и обсуждений, заключение, выводы, приложение. Указатель литературы включает 216 источников, из них 98 зарубежных. Работа иллюстрирована 9 рисунками, 52 таблицами, 67 таблицами приложения.

Заключение: 

ВЫВОДЫ

1. С-полиморфизм хромосом 1,9, 16 и У в Курской популяции характеризуется определенной вариабельностью и распространением. Установлено, что модальным классом для каждой пары хромосом в Курской популяции являются С-варианты: 2-балльные для 1 пары хромосом; 3-балльные для 9, 16 и Y хромосом. Экстремальные 5-балльные варианты наблюдались с частотой 1%. Объем С-гетерохроматина как внутри пар хромосом, так и между парами хромосом находится в тесной статистической взаимосвязи.

2. Сравнение фактически наблюдаемых балльных сочетаний С-сегментов с теоретически ожидаемыми выявило статистически достоверное смещение у первых в сторону преобладания определенных сочетаний.

3. Установлены границы вариабельности «суммарного гетерохроматина»; среднее значение адаптивной нормы по суммарному гетерохроматину составило 14,98±0,14 баллов, среднее значение при уровне меньше Х< -1а достигало 9,97±0,24, при уровне больше Х>1а - 19,97±0,21. У лиц с отклонениями в содержании суммарного гетерохроматина более или менее 1а установлена статистически достоверная дезинтеграция взаимосвязей между С-блоками исследуемых хромосом.

4. Соотношение гомоморфных и гетероморфных С-вариантов в популяции по 1 и 9 парам хромосом выявило равномерность их распределения. В 16 паре наблюдалось смещение в сторону гомоморфных С-вариантов. Многомерный анализ выявил статистически значимые взаимосвязи между объемами С-гетерохроматина в гомо- и гетероморфных группах. Объемы С- гетерохроматина по 9 и 16 парам хромосом были более сопряжены между собой, чем объемы С-сегментов 1 пары хромосом. В гомоморфных группах выявлены более сильные взаимосвязи между объемами С-гетерохроматина исследуемых хромосом по сравнению с гетероморфными группами.

5. Установлены различия в объемах гетерохроматина между возрастными группами обследованных лиц. С возрастом наблюдалось достоверное уменьшение объемов С-гетерохроматина. В 51-60 лет у мужчин и в 61-70 лет у женщин установлено его достоверное увеличение.

6. Доказано влияние изоляции расстоянием между местами рождения супругов разных поколений на объем гетерохроматина у пробандов. Выявлено статистически достоверное повышение объемов С-гетерохроматина 1 и 16 пар хромосом при коротком и промежуточном расстоянии, 9 пары - при дальнем расстоянии между местами рождения родственников пробанда.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Особенностью хромосом высших эукариот является эволюционно закрепленное существование в них двух типов хроматина (эухроматина и гетерохроматина), четко различающихся молекулярной организацией, поведением в клеточном цикле, генетическими и цитологическими особенностями. Одной из проблем в цитогенетике является выяснение вопроса о взаимосвязи между различными участками хромосом и их функциональной значимости. Природные популяции отмечаются широкой генетической вариабельностью, изучение которых привело к возникновению концепции об адаптивности и нейтральности биохимического полиморфизма [50, 65]. Хромосомный полиморфизм рассматривается также в этом контексте, однако применительно к человеку подобных работ выполнено немного, поэтому вопрос о его значимости в онтогенетическом развитии дискутируется до настоящего времени. И если роль эухромати-ческих участков в реализации генетической программы не вызывает сомнений, то роль структурного гетерохроматина, в основе которого лежит вариабельность числа тандемных повторов ДНК, в этих процессах неясна. На сегодняшний день, сформировалось представление о генетической инертности структурного гетерохроматина. Однако все большее количество фактов свидетельствует о большом значении для всей системы клеточного ядра, соотношения в нем гетерохроматиновых и эухроматиновых районов [101].

Пока весьма загадочными представляются сами районы структурного гетерохроматина, хотя знания о структуре ДНК этих районов хромосом расширяются. Остается совершенно неясным, почему в этих районах резко подавлен процесс митотического и мейотического кроссинговера. Непонятно, почему именно в районы структурного гетерохроматина происходит транспозиция МГЭ. Остается неясным механизм задержки в разделении сестринских хрома-тид в центромерном районе, несмотря на то, что он определяет правильность выполнения хромосомами их сеграционной функции в митозе и мейозе. Удивительны и пока еще непонятны факты регуляции центромерной активности: наличие гетерохроматинового блока у ряда организмов, который индуцирует нецентрическую активность в мейозе в гетерохроматиновых узелках всех других хромосом [101]. Возникающий на сегодняшний день вопрос, что же заставляет изменять время экспрессии генов? Есть основание предполагать, что существенная роль в этом принадлежит гетерохроматиновым участкам хромосом. Фе-нотипический эффект изменения количества гетерохроматина часто проявляется в раннем эмбриогенезе в виде недопредставленности клеток на орган или сохранения фетальных характеристик после рождения. Предполагают, что гетерохроматин и сателлитная ДНК оказывают воздействия на время экспрессии генов двояким способом либо ассоциируются с определенным классом белков, которые влияют на структуру хроматина, либо влияют на трехмерную организацию интерфазного ядра [54, 55].

Несмотря на многочисленные работы по изучению структурного гетерохроматина в человеческих популяциях, нет четкого представления о подверженности селективному отбору гетерохроматина. Обсуждение в литературе концепции об адаптивности хромосомного полиморфизма [30, 32, 78, 54, 55] не дает четких границ адаптивной нормы. Что же касается проблемы гомо- и гетероморфизма С-блоков, то в мировой литературе нет данных по глубокому анализу этого явления, а также связей, возникающих внутри клеточного ядра между С-гетерохроматииом при его различных сочетаниях в генотипах. В доступной литературе нам не встретилось и освещения вопроса по изоляции расстоянием и связи его с количественной представленностью структурного гетерохроматина. Недостаточно освещен вопрос хромосомного полиморфизма в по-стнатальном периоде развития человека и, в частности, связи структурного гетерохроматина с возрастом. Не проводился и многомерный анализ этих показателей с использованием современных статистических методов.

Обширные сведения относительно организации и свойств гетерохроматина пока не помогли ответить на основной вопрос, какова биологическая функция гетерохроматина.

Объективная потребность развития представлений о С-гетерохроматине определило проведение настоящего исследования. Любые новые данные в этой области будут способствовать более полному пониманию роли структурного гетерохроматина в геноме, а также в индивидуальном развитии человека.

Учитывая накопленный фактический материал о соотношении размеров С-сегментов в норме и патологии [47, 48, 51, 59, 103, 110, 111], представлялось важным осуществить сравнение собственных полученных показателей с данными, опубликованными в литературе. Самостоятельный аспект представляет важность понимания значимости полиморфизма по С-сегментам для клинической цитогенетики, знание нормы для медико-генетического консультирования. Проведенный сравнительный анализ позволил оценить процентную встречаемость С-сегментов 1,9, 16, Y хромосом и определить модальные классы для каждой пары хромосом, что в Курской области проведено впервые. Для 1 пары хромосом это оказались 2-балльные варианты, по 9, 16 и Y хромосомам 3-балльные. В исследовании показано, что экстремальные (5-балльные) варианты наблюдались с частотой 1%, что согласуется с данными литературы [32,198].

Проведенное исследование показало, что, несмотря на вероятностное сочетание хромосом независимо от объемов С-гетерохроматина, не обнаружено достоверных различий между % распределения частот С-сегментов между гомологами, это говорит о том, что объемы С-сегментов исследуемых хромосом в популяции встречаются с определенной частотой. При сравнении практически наблюдавшихся балльных сочетаний с теоретически возможными установлено выраженное смещение в сторону преобладания именно определенных балльных сочетаний. Можно полагать присутствие внутриутробного и даже постпа-тального отбора по количественному содержанию гетерохроматина в геноме при определенных условиях среды. Эта точка зрения рассматривалась рядом авторов [97,110].

В ходе исследования нами было введено понятие суммарного гетерохроматина и оценен его объем для нормального функционирующего организма. Определены границы его вариабельности, что может рассматриваться в качестве генетического показателя в практике медико-генетического консультирования. Установлено, что наибольший объем С-гетерохроматина приходится на 16 пару хромосом. Подразделение исследуемой выборки по объему суммарного гетерохроматина на группы по (Х±1а) позволило выделить адаптивную среднюю этого показателя, что соответствовало 15 баллам (75,4 %), отклонения в сторону уменьшения и увеличения на одну а было >10 баллов и <20 баллов (по 12,3%).

В современной литературе нам не удалось встретить обсуждение такого важного вопроса как взаимосвязь С-гетерохроматина между гомологами в паре хромосом, а также между самими парами исследуемых хромосом в геноме. На сегодняшний день имеется представление о том, что каждая хромосома в интерфазном ядре занимает собственную территорию. Исследователями показано, что отдельные участки хромосом человека предпочитают находиться рядом друг с другом [20, 127, 187].

Проведенный в ходе исследования многомерный анализ позволил установить, что объемы прицентромерного гетерохроматина 1,9, 16 хромосом выборки находятся в тесной статистической взаимосвязи друг с другом, с теломер-пым гетерохроматином Y хромосомы отмечались более слабые связи. С-блоки 9 и 16 пар хромосом были более сопряжены друг с другом, чем с С-блоками 1 пары хромосом. Интересен тот факт, что в группах обследуемых, имевших объемы суммарного гетерохроматина меньше и больше 1а, наблюдали изменения взаимосвязей между С-блоками по отношению к адаптивной средней норме.

В литературе не уделено должного внимания роли асимметрии прицентромерного гетерохроматина между гомологами хромосом и что стоит за гетероморфизмом хромосом. Рядом исследователей была показана связь увеличения гетероморфизма гомологов у родителей, приводящая к дестабилизации мейоза и коориентации не гомологов [90]. Показано и то, что избыток гетерохроматина приводит к нарушению метаболизма клеток, эмбриогенеза и морфогенеза [111]. Отмечено, что гетероморфные варианты преобладали у спонтанных абортов [78]. Высказывалось предположение, что гетероморфизм между гомологами безвреден лишь до определенного уровня, переход за который у некоторых носителей сопровождался риском нарушений в развитии либо у них самих, либо чаще у их детей [114].

Впервые нами предпринята попытка в оценке гомо- и гетероморфизма С-сегментов, выяснения причинно-следственных связей между объемами С-гетерохроматина гомологов в паре исследуемых хромосом, а также и их попарное сравнение при различных сочетаниях в геноме (по одной паре, по двум, по трем парам хромосом) и проанализированы взаимосвязи при данных сочетаниях.

В результате нашего исследования установлено, что соотношение гомоморфных и гетероморфных вариантов в Курской популяции по 1 и 9 парам хромосом распределено поровну, а в 16 паре хромосом наблюдалось смещение в сторону гомоморфных вариантов. Сравнительный анализ встречаемости гомо- и гетероморфных вариантов продемонстрировал их независимый характер, а выявленные достоверные различия процентной встречаемости свидетельствовали о преобладании в популяции определенных С-вариантов исследуемых хромосом.

Одной из задач, решаемых в настоящем исследовании являлось выяснение вопроса о существовании связи между объемами С-гетерохроматина каждой хромосомы как внутри своей пары, так и друг с другом, а также с суммарным гетерохроматином, учитывая различные по парные сочетания ( по одной, двум, трем парам), а также гомо- и гетероморфизм. Для ответа на этот вопрос был проведен многомерный анализ статистическими методами: корреляционным, кластерным, дискриминантным. Сравнительный анализ корреляционных связей во всех группах показал, что С-блоки всех исследуемых хромосом находятся в достоверной линейной взаимосвязи между собой (от г=0,20 при р< 0,01 и выше). Следует отметить, что с суммарным гетерохроматином все С-блоки исследуемых хромосом находились в тесной взаимосвязи. В гомоморфных группах (по 1-й, 2-м и 3-м парам хромосом) отмечались более сильные взаимодействия между объемами С-гетерохроматина данных хромосом, чем в гетероморфных группах. Было показано, что объемы гетерохроматина по 9 и 16 парам хромосом более сопряжены, чем с объемами гетерохроматина 1 пары хромосом. Таким образом, тесная взаимосвязь С-блоков 1,9, 16 и Y хромосом может свидетельствовать в пользу предположения о взаимосвязи С-гетерохроматина, о том, что гетерохроматин в геноме существует как целостная структура со своими особыми функциями.

Как уже говорилось, оценке объема С-гетерохроматина хромосом человека в различные возрастные периоды посвящено немного работ [3,57,61,62,78,103]. Вследствие противоречивости результатов этих работ мы предприняли попытку исследовать проявления С-гетерохроматина в разных возрастных группах. Данные нашего исследования показали уменьшение объемов С - гетерохроматина с возрастом, что согласуется с литературными данными [57]. У мужчин наименьшая величина объема С-блоков отмечалась в 4 и 6 возрастных подгруппах, у женщин в 5 подгруппе. Но в 6-х подгруппах у женщин и мужчин отмечалось более высокое содержание С-гетерохроматина в исследуемых хромосомах по сравнению с предыдущей подгруппой. Увеличение структурного гетерохроматина в старшей возрастной группе совпадает с данными Кузнецовой С.М., показавшей в своих работах увеличение структурного гетерохроматина у долгожителей [62]. В ходе исследования было установлено, что количественное содержание объема С-гетерохроматипа по каждой паре хромосом изменялось, как у мужчин, так и у женщин в разных возрастных подгруппах. Так, частота С-гетерохроматиповых районов 1 пары хромосом, как у мужчин, так и у женщин изменялись во всех возрастных подгруппах, с уменьшением объема в каждой последующей возрастной подгруппе, за исключением 6, в которой отмечалось увеличение объема С-гетерохроматина. Частота полиморфизма С-блоков 9, 16 пар и Y хромосом у мужчин имела сходную картину изменчивости, постепенное уменьшение объема с возрастом, и с увеличением объема в 5 возрастной подгруппе, со снижением в 6 возрастной подгруппе. У женщин полиморфизм объемов С-гетерохроматина 9 и 16 пар хромосом носил неопределенный характер, с наибольшим размером С-блока в 3 возрастной подгруппе. При оценке суммарного гетерохроматина было выяснено, что в 1 возрастной подгруппе у мужчин максимальное значение суммарного гетерохроматина выше, чем у женщин. Наибольший объем суммарного гетерохроматина у мужчин отмечался в 5 возрастной подгруппе, у женщин - в 3 подгруппе.

Отмечается общая тенденция к уменьшению величины С-гетерохроматина с возрастом. Таким образом, преобладание определенных объемов С-гетерохроматина в разных возрастных периодах возможно связано с селективным отбором в эти периоды онтогенеза данных вариантов, как наиболее адаптивных.

Проведенное сравнение средних значений С-гетерохроматина в разных возрастных периодах как внутри групп мужчин и женщин, так и между самими группами показали достоверные различия в количестве С-гетерохроматина в ряде онтогенетических периодов. Таким образом, в разные возрастные периоды преобладают определенные объемы С-гетерохроматина, и что мужские и женские геномы отличаются по количественному содержанию гетерохроматина.

Одним из этапов исследования было проведение многомерного анализа. В ходе исследования отмечались определенные корреляционные связи С-гетерохроматина исследуемых хромосом с возрастом. В основном, корреляции отмечались для С-сегментов 1 и 9 пар хромосом как у мужчин, так и женщин. Полученные результаты свидетельствуют о стабильности большинства С-гетерохроматиновых участков у индивидов разных возрастных групп и отрицательной корреляции с возрастом некоторых С-сегментов отдельных хромосом, что возможно связано с увеличением степени спирализации или же возможности селективного эффекта, который может приводить к изменению частот хромосомных вариантов у лиц разных возрастных групп. Проведенный дискриминантный анализ позволил выделить значимые С-гетерохроматиновые блоки исследуемых хромосом, по которым отличались исследуемые группы и возрастные подгруппы.

Для оценки степени влияния таких факторов как возраст и пол на объем С-гетерохроматина исследуемых хромосом, и выяснения существенности и оценке этого влияния был проведен дисперсионный анализ. В ходе него было установлено, что объемы С-гетерохроматина 1 пары хромосом и Y хромосомы у мужчин зависят от фактора возраста. У женщин эта зависимость отмечалась для объемов С-блоков 1 пары хромосом и суммарного гетерохроматина. Perрессионный анализ подтвердил полученные данные и позволил построить прогнозирующие уравнения регрессии с удовлетворительной аппроксимацией.

Таким образом, полученные результаты дают основание полагать, что частота объемов С-гетерохроматина изменяется в онтогенезе, что обусловлено либо изменением скоростью конденсации хромосом с возрастом, или же возможным селективным отбором, который и приводит к изменению объемов С-гетерохроматина с возрастом.

В литературе отсутствуют работы, посвященные изучению влиянию изоляции расстоянием между местами рождения предков на величину объема С-гетерохроматина у пробандов. Данные нашего исследования показали, что уже на уровне стандартной статистики, между размерами С-гетерохроматина изучаемых хромосом существуют достоверные различия. Средние размеры С-блоков 1 и 16 пар хромосом достоверно отличались в сторону увеличения объемов С-гетерохроматипа у лиц, имеющих родителей из одной области и уменьшения объемов С-гетерохроматина у лиц, имеющих родителей рожденных в разных областях. Средние размеры С-блоков 9 пары хромосом достоверно отличались в группах, родители которых проживали в одном районе от исследуемых из одной области с уменьшением объемов и увеличением объема С-гетерохроматина этой хромосомы у лиц, рожденных в разных областях. Объем суммарного гетерохроматина уменьшался с увеличением расстояния между супругами 1 и 2 поколений. С-блок Y хромосомы имел увеличенный объем у лиц, имеющих бабушек-дедушек, рожденных в одном районе.

Проведенные многомерные анализы: корреляционный, дисперсионный, регрессионный также показали влияние расстояния между местами рождения предков на количественную представленность прицентромерного гетерохроматина в геноме у пробандов.

Таким образом, расстояние между местами рождения родителей пробандов оказывает влияние на величину С-сегментов хромосом, причем, чем дальше расстояние, тем более выражена зависимость. В тех случаях, когда родители (F2 поколение) были рождены в одной местности, зависимость отмечалась по материнской линии. В случаях, когда F2 поколение рождено в разных местностях, влияние на объем С-сегментов оказывало расстояние между местами рождения по отцовской линии. Показано, что для объемов 1 пары было характерно, чем ближе места рождения между родителями, и между супругами F] поколения по отцовской линии, тем больше был С-гетерохроматиновый блок. По объему 9 пары хромосом - противоположная картина, чем дальше места рождения родителей и бабушек-дедушек по линии отца, тем больше С-гетрохроматин. Объем С-гетерохроматина 16 пары хромосом больше, чем ближе места рождения родителей и бабушек-дедушек по линии матери. Объем суммарного гетерохроматина уменьшался с дальностью расстояния между местами рождения родственников F] и F2 поколения пробапдов.

Таким образом, длительное проживание нескольких поколений в одной местности приводит к увеличению объема С-гетерохроматина 1 и 16 пар хромосом, а также всего суммарного гетерохроматина. Увеличение объема гетерохроматина 9 пары хромосом зависит от дальности рождения предков. Данный факт можно рассматривать как один из механизмов адаптации к определенным факторам среды обитания. Полученные данные требуют дальнейшего накопления материала и изучения на молекулярно-генетическом уровне.

Таким образом, в заключение можно отметить, что проведенное исследование позволило впервые оценить с помощью многомерного анализа, вариабельность С-гетерохроматина в Курской популяции, оценить действие селективного отбора по наиболее благоприятному содержанию гетерохроматина, оценить гомо- и гетероморфизм по С-сегментам гомологичных хромосом и выяснить взаимосвязи между ними. Проведен многомерный анализ и оценено влияние возраста на количественную представленность С-гетерохроматина. Впервые показано роль изоляции расстоянием между местами рождения двух поколений на количественное содержание объемов С-гетерохроматина 1,9, 16 и Y хромосом в популяции. Результаты настоящего исследования дают основание сформулировать ряд выводов.

Начало формы

Конец формы

Начало формы

Конец формы