Молекулярные основы наследственности. Строение молекулы ДНК. Функции ДНК.

Генетика изучает фундаментальные свойства живого - наследственность и изменчивость, которые реализуются при помощи нуклеиновых кислот.

Нуклеиновые кислоты представляют собой линейные информационные биополимеры. Существует два основных типа нуклеиновых кислот – дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) и рибонуклеиновые кислоты (РНК).

Молекула ДНК как материальный носитель наследственности многофункциональна. Она сохраняет наследственную информацию, закодированную в последовательность нуклеотидов единицы транскрипции гена. Посредством дифференциальной экспрессии генов и синтеза белков (транскрипция и трансляция) ДНК формирует специализированные клеточные фенотипы. Посредством репликации и генетического контроля митоза и мейоза ДНК передает наследственные признаки потомкам.

Физиология ДНК реализуется в генетических процессах: транскрипции, трансляции, репликации, генетической рекомбинации, репарации.

РНК специализированы и выполняют различные функции, связанные с функциональной активностью ДНК. Различают рибосомные РНК (рРНК), матричные РНК (мРНК), транспортные РНК (тРНК), малые ядреные и малые цитоплазматические РНК. Все они участвуют в реализации генетической информации, закодированной в ДНК. Лишь в РНК-содержащих вирусах РНК являются геномными, т.е. хранят и передают следующему поколению соответствующую генетическую информацию.

В этой связи основной алгоритм генетики выглядит как:

РНК-полимераза

ДНК (генотип) → РНК → белки (фенотип)

обратная ↑ ↓ДНК-полимераза

транскриптаза

РНК ДНК

Нуклеиновые кислоты как биополимеры характеризуются следующими основными свойствами.

Размеры молекул и их молекулярная масса. ДНК, выделенные из разных организмов, являются макромолекулами и состоят из огромного числа (до нескольких миллиардов) мономе­ров - нуклеотидов и имеют большие молекулярные массы. Молекулы ДНК линейные (в ядрах эукариот) или перекрученные кольцевые (хромосомы и плазмиды бактерий, ДНК-содержащие вирусы, митохондрии, пластиды, кинетопласты). Однонитевая ДНК обнаружена у некоторых фагов (фаг φ Х174В).

Молекулы специализированных РНК сильно различаются по размерам. Например, тРНК состоят в среднем из 80 нуклеотидов и имеют молекулярную массу около 25 кДа. Однако геномные РНК вирусов состоят из десятков тысяч нуклеотидов, их молекулярная масса может достигать 10000 кДа.

РНК являются однонитевыми молекулами, но они имеют динамичную конформацию. В молекулах РНК последовательности комплементарных оснований могут за счет водородных связей образовывать двухцепочечные фрагменты, увеличивающие стабильность их молекул. Так называемые «шпильки» включают в себя участки с одинаковой, но противоположно ориентированной («палиндромной») последовательностью комплементарных оснований.

Мономеры, из которых построены молекулы нуклеиновых кислот. Нуклеиновые кислоты состоят из 4 нуклеотидов, которые в зависимости от порядка расположения образуют линейную последовательность, которая может быть как кодирующей, так и некодирующей. Нуклеотиды состоят из азотистого основания, остатка рибозы (в РНК) и дезоксирибозы (в ДНК) и фосфорной кислоты. В состав ДНК входят четыре типа азотистых оснований: пурины – аденин и гуанин, и пиримидины - цитозин и тимин. В РНК входят, как и в ДНК - аденин, гуанин и цитозин, но вместо тимина используется урацил.

В нуклеиновых кислотах в небольших количествах присутствуют минорные азотистые основания: у высших животных и высших растений 5-метилцитозин. У фагов 5-оксиметилцитозин используется вместо цитозина. В неко­торых типах РНК в незначительном количестве встречаются псевдоуридин, метилгуанин и другие минорные основания.

Ковалентная связь, соединяющая нуклеотиды в линейную последовательность (первичная структура). Нуклеотиды соединяются фосфодиэфирными связями, образующимися между 5' углеродом одного остатка сахара и 3' углеродом другого остатка сахара.

Молекула ДНК обладает полярностью; условно принято приписывать этим молекулам направление от 5’ атома к 3’ атому углерода остатков дезоксирибозы.

Уровни структурной организации хроматина. На основании рентгенографическо­го исследования и биохимических дан­ных Уотсон и Кри­к (1953) предложили мо­дель молекулы ДНК.

ДНК со­стоит из двух цепей, образующих правозакрученную спираль с диаметром око­ло 2 нм и шагом около 3,4 нм. На один шаг (период идентичности) приходится 10 пар нукле­отидов. При этом сахарофосфатный остов каждой из цепей обращен наружу, а азотистые основания направлены внутрь спирали и комлементарно взаимодействуют друг с другом. Функциональные группы аденина образуют две водородные связи с тимином другой цепи, а гуанин взаимодействует с цитозином посредством трех водородных связи.

Химический состав ДНК починяется следующим закономерностям. В ДНК количество пуринов равно количеству пиримидинов. Согласно правилу эквивалентности отношения аденин/тимин и цитозин/гуанин) близки к 1. ДНК каждого вида обладает характерным составом, который характеризуют отношением (А + Т)/(Г + Ц). В бактериях могут преобладать либо А + Т либо Г + Ц. У высших животных величина этого отношения колеблется в пределах 1,3 – 1,5; у высших растений эта величина находится в пределах 1,1 – 1,7. Для человека эта величина составляет 1, 51 (по Уотсону).

ДНК в клетках живых организмов существует либо в виде хроматина, либо в виде хромосом, различающихся степенью конденсации и транскрипционной активностью. В этой связи различают транскрипционно активный эухроматин и неактивный гетерохроматин. Максимальная степень конденсации характерна для метафазных хромосом.

Образование хроматина происходит в результате взаимодействия ДНК с гистоновыми и негистоновыми белками, последовательной укладки.

В хроматин входят гистоны пяти типов: Н1 (линкерный гистон) и Н2А, Н2В, Н3, Н4 (нуклеосомные гистоны). Негистоновые белки представлены структурными белками, регуляторными белками и ферментами. В частности в функционировании ДНК важную роль играют белки HMG (High Mobility Group).

Различают несколько уровней упаковки ДНК в хроматин.

В начале ДНК взаимодействует с гистоновыми белками с образованием нуклеосом. Основу нуклеосомы составляет гистоновый октамер, в который входит по две молекулы разных гистонов. Нуклеосому «обматывает» фрагмент ДНК длиной около 200 п.н.. Линкерный фрагмент ДНК, остающийся между двумя нуклеосомами имеет длину до 60 п.н.. Нуклеосомный уровень организации ДНК позволяет компактизировать ее молекулу в 6–7 раз и приводит к образованию нити хроматина толщиной 10 мкм.

Нуклеосомы укладываются в хроматиновую фибриллу. Согласно соленоидной модели, на каждый виток фибриллы, имеющей толщину около 30 мкм, приходится 6-7 нуклеосом. При этом размеры ДНК уменьшаются в 25-30 раз.

Хроматиновые фибриллы формируют петлеобразные структуры, в которых образуются суперспирализованные домены, содержащие 15-150 тыс. п.н.. Петли хроматина отходят под углом от основной оси хромосомы. Данная схема организации видна при анализе в световой микроскоп интерфазных хромосом типа «ламповых щеток». Фиксацию петель хроматина по середине и в целом осуществляют специфические белки.

Доменная организация обеспечивает специфическую укладку хроматина в метафазных хромосомах. Поперечная исчерченность митотических хромосом в определенной мере отражает порядок расположения генов в молекуле ДНК.

Рисунок 1.1 - Уровни структурной упаковки хроматина

Молекула ДНК имеет динамичную конформацию, функционирование ДНК связано с переходом гетерохроматина в эухроматин.

Рисунок 1.2 - Модель организации интерфазной хромосомы, основанная на представлении об организации ядерного матрикса как системы канальцев (цит. по Корочкин Л.И. 2002)

Функциональной единицей ДНК является ген. Ген функционирует как элемент генома. Геномом называется одинарный полный набор генетического материала организма. В него входят последовательности нуклеотидов ДНК гаплоидного набора хромосом, ДНК митохондрий и хлоропластов.

Величина генома выражается в парах нуклеотидов (п.н.). Геном человека состоит из 3,5x10⁹ п.н.. Изучением геномов организмов, относящихся к различным таксономическим группам, занимается геномика (структурная, функциональная, эволюционная).

Ген рассматривают как совокупность сегментов ДНК (единицу транскрипции, регуляторные последовательности и др.), , которые образуют экспрессирущуюся единицу, обусловливающую образование специфи­ческой функциональной РНК или белка. Единица транскрипции представляет собой - протяженный участок ДНК, кодирующий по­следовательность первичного РНК-транскрипта. Единицу транскрипции составляют кодирующая последовательность, 5'-лидерная последовательность и 3'-трейлерная последовательность, которые транскрибируются, но не транслируются. В генах, кодирующих рРНК, имеются промежуточные последовательности (спейсеры), удаляемые в ходе процессинга первичных РНК-транскриптов.

Правильную транскрипцию организует промотор, однако и для образования правильного 3'-конца зрелой РНК также существует специфическая последовательность. К регуляторным последовательностям относят энхансеры (позитивная регуляция) и сайленсеры (негативная регуляция), которые влияют на инициацию транс­крипции гена, хотя сами могут находиться на значительном удалении от точки инициации транскрипции.

Гены прокариот структурно организованы достаточно просто. Промотор находится под контролем регуляторного элемента, и вся эта конструкция определяет эффективность процесса транскрипции с единицы транскрипции гена. У прокариот различают гены, кодирующие один белок и гены, кодирующие несколько белков. В последнем случае единица транскрипции гена является полицистронной. Организация нескольких генов в оперон (полицистронная единица транскрипции) стала эволюционным достижением прокариот. Несколько генов, кодирующих белки, участвующие в едином метаболическом цикле, оказываются под влиянием одного регуляторного элемента (лактозный, триптофановый, арабинозный опероны).

Гены вирусов и бактериофагов имеют по сравнению с генами прокариот более сложное строение, поскольку их генетические процессы зависят от геномов клеток хозяев, в которых и осуществляется их клеточный цикл. В частности, у бактериофагов отмечено перекрывание генов, у вирусов наряду с экзонами присутствуют интроны.

Внутренние правые

регуляторные элементы регуляторные

промотор элементы

5´ +1 экзон 1 экзон 2 экзон 3 3´

3 ´ левые интрон 1 интрон 2 3´трейлерная 5´

регуляторные ↑ последовательность

элементы 5´лидерная

последовательность

Единица транскрипции------//

Рисунок 1.3 - Структурные особенности гена эукариот, кодирующего белок. Транскрипция осуществляется слева направо. Значащая цепь имеет левый 5-конец и правый 3-конец. Положение первого нуклеотида транскрипта обозначают числом +1, а нуклеотидов, расположе­нных справа от него (т.е. внутри еди­ницы транскрипции), большими положительными числами (например, + 29). Нуклеотиды, находящие­ся слева от +1 (нетранскрибируемые последовательности), обозначаются отрицательными числами (например, -55) (Сингер, Берг, 1997)

Гены эукариот имеют сложную организацию, обусловленную усложнением генетического контроля над их экспрессией. Они имеют прерывистое мозаичное строение: экзоны (кодирующие последовательности), разделяются интронами (вставочные последовательности). Как правило, длина интронов в несколько раз превышает длину экзонов. Различают три класса генов эукариот. Гены класса 1 кодируют рРНК, гены класса 2 кодируют мРНК, гены класса 3 кодируют тРНК. Гены разных классов имеют характерные особенности промоторов и транскрибируются различными РНК-полимеразами.

Типичный ген человека состоит в среднем из 28000 оснований (в кодирующую последовательность входят 1340 п.н.) и содержит восемь экзонов.

Существует несколько классификаций генов. В зависимости от локализации в клетке различают ядерные, и цитоплазматические гены, локализованные в хлоропластах и митохондриях. По функциональному значению различают: структурные гены, кодирующие белки (их выявляют с помощью мутаций, нарушающих структуру белков), и регуляторные гены, участвующие в регуляции экспрессии гена. В зависимости от того, как влияют гены, точнее их белковые продукты на физиологические процессы различают: летальные, условно летальные, супервитальные гены, гены-мутаторы, гены-антимутаторы и другие.

Гены объединяются в генные сети, под влиянием (генетическим контролем) которых находятся все метаболические и физиологические процессы в организме. Под регуляторным контролем генных сетей находится деление клетки (митоз и мейоз). Эмбриогенез также находится под влиянием сложных и разветвленных генных сетей. Выделяют группы тесно сцепленных генов, образующих кластеры, которые проявляют свое действие последовательно, и определяют нормальную сегментацию тела, получившие название гомеобоксных генов. Под их влиянием запускается определенный путь эмбрионального развития: в контролируемых клетках экспрессируется специфический набор генов и в результате формируется тот или иной сегмент тела. В частности, гены комплекса bithorax (ВХ-С) дрозофилы необходимы для нормальной сегментации груди (thorax) и брюшка (abdomen). Гомеобоксные гены впервые были выявлены у дрозофилы, но они также обнаружены и у млекопитающих, причем у разных организмов они имеют высокую гомологию.

Первичные РНК-транскрипты, образующиеся в ядрах эукариотических клеток, созревают. Важнейшим этапом образования функционально активных молекул РНК является сплайсинг, протекающий по следующей схеме. Специфические рестриктазы разрезают РНК-транскрипт по границам экзон-интрон, затем фрагменты РНК, соответствующие экзонам, сшиваются лигазой.

Фенотипическое разнообразие клеток эукариот определяется спектром синтезируемых в них белков, что в свою очередь связано с дифференциальной экспрессией генов. Подчеркнем, что экспрессия генов тонко регулируется, но контроль над генетическими процессами осуществляется также и на уровне созревания РНК и на уровне трансляции.

ДНК в изобилии содержит некодирующие последовательности, которые, как полагают, могут участвовать в регуляции активности генов и организации хромосом. Среди некодирующих участков доминируют повторяющиеся последовательности, которые могут быть короткими, как, например динуклеотидный повтор GCGCGCGC…, или длинными, например, Alu-последовательность, имеющая протяженность около 300 п.н. Отметим, что такие последовательности в геноме человека могут повторяться до 300000 раз, занимая до 5% всего генома. Повторяющиеся последовательности с различным числом копий используют для оценки изменчивости в популяциях.

В геномах эукариот микросателлитные последовательности – короткие тандемные повторы (STR – short tandem repeats) имеют небольшую длину (2-6 нуклеотидов). У человека изучено более 5000 вариабельных динуклеотидных микросателлитных последовательностей, которые рассеяны по всему геному.

Среди повторяющихся последовательностей встречаются псевдогены, которые возникают вследствие мутаций (делеции или вставки), приводящих к изменению рамки считывания. Псевдогены неспособны производить функциональные РНК-продукты. Семейство генов главного комплекса гистосовместимости (МНС) состоит более чем из 100 генов, в числе которых и псевдогены.

Важнейшей составляющей геномов являются ДНК-мобильные элементы, которые способны перемещаться по геному и во многом влияющие на процесс генетической рекомбинации.

ДНК реализует генетическую активность в генетических процессах: транскрипции, трансляции, репликации, репарации и генетической рекомбинации.

Способность ДНК к метаболическим превращениям лежит в основе генетических процессов – репликации, репарации - сохраняющих святая святых клетки ее гены. Важнейшая роль ДНК - организация матричного синтеза. Транскрибирование генов направлено на образование различных РНК-продуктов (транскриптов) из которых в процессе созревания образуются мРНК, рРНК, тРНК и другие РНК, обладающие регуляторной активностью или выполняющие структурные функции.

Для правильной транскрипции в гене должны присутствовать: кодон инициации, множество смысловых кодонов и кодон терминации. Три подряд расположенных нуклеотида представляют собой кодон, который и определяет, какая аминокислота будет располагаться в данной позиции в белке. Например, в молекуле ДНК последовательность оснований ТАС является кодоном для аминокислоты метионина, а последовательность ТТТ кодирует фенилаланин. В молекуле мРНК вместо тимина (Т) присутствует основание урацил (У). Таблица генетического кода во всех руководствах представлена символами мРНК. Из 64 возможных кодонов смысловыми являются 61, а три триплета - УАА, УАГ, УГА - не кодируют аминокислоты и поэтому были названы бессмысленными, однако на самом деле они представляют собой знаки терминации трансляции.

Генетическая рекомбинация представляет собой реорганизацию генома, направленную на создание таких комбинаций генов и регуляторных элементов, которые были бы в плане регуляции более эффективными.

Методология анализа нуклеиновых кислот постоянно развивается и пополняется новыми молекулярными методами исследования. Современными научными направлениями являются генотипирование (характеристика последовательностей ДНК, выявление мутаций) и фенотипирование (определение белкового разнообразия в клетке и организме). Структуру генов изучают посредством молекулярного клонирования и секвенирования ДНК.

Репликация днк

Матричный синтез

Способность генетического материала, ДНК, к самовоспроизведению (репликации) лежит в основе размножения живых организмов, передачи наследственных свойств из поколения в поколение и раз­вития многоклеточного организма из зиготы. Модель ДНК Уотсона и Крика сразу же позволила понять принцип удвоения ДНК. Поскольку каждая из цепей ДНК содержит последовательность нуклеотидов, комплементарную другой цепи, т. е. их информационное содержание идентично, представлялось вполне логичным, что при удвоении ДНК цепи расходятся, а затем каждая цепь служит матрицей, на которой выстраивается комплементарная ей новая цепь ДНК. В результате образуются два дуп­лекса ДНК, каждый из которых состоит из одной цепи исходной родительской молекулы ДНК и одной новосинтезированной цепи. Экспериментально показано, что именно так, по полуконсервативно­му механизму, происходит репликация ДНК.

Несмотря на простоту основного принципа, процесс репликации сложно организован и требует участия множества белков. Эти белки, как и все другие, закодированы в последовательности нуклеотидов ДНК. Таким образом, возникает важнейшая для жизни петля обратной связи: ДНК направляет синтез белков, которые реплицируют ДНК.

ДНК- полимеразы

Комплементарное копирование матрицы осуществляют ферменты ДНК-зависимые ДНК-полимеразы или просто ДНК-полимеразы. ДНК-полимеразы ведут синтез ДНК на одноцепочечной матрице фрагмент растущей цепи ДНК. ДНК-полимеразы последовательно наращивают конец затравки, шаг за шагом присоединяя к нему следующие нуклеотиды, причем выбор очередного нуклеотида для присоединения к концу затравки диктуется матрицей.

Очередной нуклеотид, субстрат для ДНК-полимеразы, поступает в реакцию в активированной высокоэнергетической форме дезокси-рибонуклеозидтрифосфата. В этом отношении синтез ДНК напоминает синтез всех других биополимеров: поскольку полимеризация мономеров в полимер энергетически не выгодна, мономеры всегда поступают в реакцию синтеза в активированной форме. В случае синтеза ДНК присоединение очередного нуклеотида к концу затравки сопровождается гидролизом богатой энергией связи и отщеплением пирофосфата, что и делает реакцию в целом энергетически выгодной. Наличие в клетке пирофосфатазы обеспечивает расщеп­ление пирофосфата и делает реакцию практически необратимой. При полимеризации растет всегда 3'-конец затравки, т. е. синтез происходит в направлении 5'3': 3'-ОН-группа концевого нуклеотида затравки атакует -фосфат очередного дезоксирибонуклеозидтрифосфата (но только в том случае, если он комплементарен очередному нуклеотиду матрицы), в результате чего отщепляется пирофосфат, а дезоксирибонуклеозид- монофосфат оказывается связанным фосфодиэфирной связью с растущей цепью ДНК, удлиняя ее на одно звено.

Затравка антипараллельна матрице. Естественно, эта полярность сохраняется и при ее дальнейшем росте, так что результатом работы ДНК-полимеразы на одноцепочечной матрице является антипараллельная двойная спираль ДНК.

ДНК-полимеразы безразличны к последовательности нуклеотидов матрицы; задача этих ферментов — снять точную копию с матрицы, с какой — неважно.

Точность синтеза ДНК и коррекция

Нормальное размножение клеток требует высокой точности копирования ДНК-матрицы. Генетический материал живых организмов имеет огромные размеры. Оказывается, у всех организмов точность работы репликативной машины (включающей не только ДНК-полимеразы, но и другие белки) как раз такова, чтобы обеспечить безошибочное воспроизведение всего генома или допустить лишь малое число ошибок. Так, у бактерий ошибки синтеза ДНК происходят не чаще чем один раз на много миллионов нуклеотидов. Молекуляр­ные взаимодействия, на которых основаны ферментативные реакции, в частности синтез ДНК, не могут быть абсолютно надежными, кроме того, точность процесса связана с его скоростью. Для того чтобы обеспечить высокую точность наряду с высокой скоростью репликации, природе пришлось прибегнуть к специальным механизмам, один из которых — механизм коррекции.

ДНК-полимеразы проверяют комплементарность каждого нук­леотида матрице дважды: один раз перед включением его в состав растущей цепи и второй раз перед тем, как включить следующий нуклеотид. Очередная фосфодиэфирная связь образуется лишь в том случае, если последний (3'-концевой) нуклеотид затравки комплементарен матрице. Если же на предыдущей стадии полимериза­ции произошла ошибка (например, из-за того, что нуклеотид в момент полимеризации находился в необычной таутомерией форме), то репликация останавливается до тех пор, пока неправильный нук­леотид не будет удален. Некоторые ДНК-полимеразы обладают не только полимеризующей, но и 3'-экзонуклеазной активностью, которая отщепляет не спаренный с матрицей нуклеотид затравки, после чего полимеризация восстанавливается. Этот механизм, кор­рекция, заметно увеличивает точность работы ДНК-полимераз. Мутации, нарушающие 3'-экзонуклеазную активность ДНК-полимеразы, существенно повышают частоту возникновения прочих мутаций. Напротив, мутации, приводящие к усилению экзонуклеазной актив­ности относительно полимеризующей, снижают темп мутирования генетического материала.

Разные ДНК-полимеразы одного организма и ДНК-полимеразы различных организмов имеют разное строение. Иногда один полипептид обладает и полимеразной, и 3'-экзонуклеазной активностя­ми, в других случаях за эти активности ответственны разные субъединицы мультисубъединичного фермента. У некоторых ДНК-полимераз корректирующая экзонуклеазная активность не обнаружена. Не исключено, что за коррекцию в этих случаях ответствен отдельный белок. [8]

Основные принципы репликации

Инициация цепей ДНК

ДНК-полимеразы не способны инициировать новые цепи ДНК. Они могут лишь достраивать уже имеющуюся затравку. Иными словами, синтез ДНК начинается с синтеза РНК. РНК-затравку для синтеза ДНК образует специальный фермент, называемый ДНК-праймазой (от англ праймер — затравка). Праймаза может быть отдельным ферментом, как у бактерий, или входить в качестве субъединицы в ДНК-полимеразу (как у ДНК-полимеразы а животных). В любом случае праймаза — это фермент, отличный от РНК-полимераз, синтезирующих разнообразные клеточные РНК и тоже способных инициировать синтез новых полинуклеотидных цепей. После того как цепь ДНК начала синтезироваться, РНК-затравки удаляются и образовавшиеся бреши застраиваются ДНК-полимеразой, т. е. с высокой точностью.

Расплетание двойной спирали ДНК в ходе репликации

Нативные ДНК двуспиральны; следовательно, перед репликацией цепи родительской молекулы, матричные цепи ДНК, должны быть разделены. Эту реакцию осуществляют два типа белков: хеликазы и SSB-белки (от англ, single strand binding — белки, связывающиеся с однонитевой ДНК). Хеликазами называют ДНК-зависимые АТРа-зы, использующие энергию гидролиза АТР для расплетания двойной спирали (helix) ДНК. Считает­ся, что хеликаза, движимая гидролизом АТР, однонаправленно «едет» по одной из цепей ДНК, расплетая перед собой двойную спи­раль. Есть хеликазы, которые едут от 5'-конца к 3'-концу цепи ДНК, и есть другие, перемещающиеся в обратном направлении. В резуль­тате работы хеликаз возникает «вилка» из двуспирального участка ДНК и двух одноцепочечных ветвей. Ренатурации одноцепочечных участков ДНК препятствует их связывание SSB-белком, имеющим избирательное сродство к однонитевой ДНК (рис. 3).

SSB-белки и хеликазы обнаружены у мно­гих про- и эукариотических организмов. Роль SSB-белка в реплика­ции, по-видимому, состоит в том, чтобы расправить ДНК, вытянуть ее и удалить возможные элементы вторичной структуры, которые могли бы образоваться в самокомплементарных участках ДНК. Связывание одноцепочечной ДНК с SSB-белком стимулирует ДНК- полимеразу и повышает точность ее работы. Этот эффект вызывается не только разрушением вторичной структуры одноцепочечной ДНК, но и непосредственным взаимодействием ДНК-полимеразы с SSB-белком, поскольку обычно полимеразу стимулирует лишь «свой» SSB-белок, но не аналогичный белок из другого источника. SSB-белок Е. coli — тетрамер, состоящий из идентичных субъединиц размером 19 кД. SSB-белок связывается с ДНК кооперативно, т. е. за счет белок-белковых взаимодействий тетрамеры покрывают ДНК вплотную друг к другу.

Рисунок 3. Расплетание двойной спирали ДНК хеликазой и SSB-белком

Прерывистый синтез ДНК

Так как цепи ДНК в дуплексе антипараллельны, то очевидно, что направление расплетания двойной спирали при репликации совпадает с направлением синтеза ДНК лишь для одной матричной цепи, но противоположно направлению синтеза ДНК на комплементарной матрице (рис. 4). Это значит, что лишь на одной из матричных цепей синтез ДНК может происходить непрерывно. Показано, что ДНК синтезируется сравнительно короткими фрагментами, называемыми фрагментами Оказаки. Таким образом, синтез ДНК на двух матричных цепях исходной молекулы заметно различается. Новосинтезированная цепь, которая синтезируется непрерывно, называется ведущей (англ, leading), другая цепь называется запаздывающей (англ, lagging). Каждый фрагмент Оказаки имеет на 5'-конце несколько рибонуклеоти-дов — результат действия праймазы. Характерный размер фрагментов Оказаки различается для бактерий и эукариот: у бактерий они имеют длину около 1000 нуклеотидов, у эукариот они короче, порядка 100 нуклеотидов. Через некоторое время после синтеза РНК-затравки удаляются, бреши застраиваются ДНК-полимеразой, а фрагменты сшиваются в одну ковалентно-непрерывную цепь ДНК предназначенным специально для этого ферментом, ДНК-лигазой. ДНК-лигазы обнаружены у самых разных организмов. Они нуждаются в высокоэнергетических кофакторах.

Репликатитвная вилка

Рисунок участка ДНК в районе репликативной вилки