БИЛЕТ 11. 1. Основные этапы и результаты Международного проекта "Геном человека".    Основные этапы и результаты работы проекта «Геном человека»     В 1988 г. один из первооткрывателей знаменитой двойной спирали ДНК, нобелевский лауреат Дж. Уотсон, публично высказал мысль о том, что наука вплотную приблизилась к раскрытию химической основы наследственности человека. К тому времени было уже известно, что наследственный аппарат человека, геном, составляет около 3 млрд. нуклеотидных пар. В то время эта величина казалась необозримо большой, и сама мысль, что такой объем информации может быть получен, представлялась совершенно фантастической.     В 1980-е годы технологии были слишком примитивными для решения задачи расшифровки генома и среди биологов было много противников этого проекта. Биологи всерьез опасались, что их всех заставят бесконечное количество раз выполнять скучные операции с ДНК человека. Как сказал один юный кандидат наук: «Я не хочу положить свою жизнь на то, чтобы определить последовательность 12-й хромосомы от 100 000-й до 200 000-й пары оснований». Такие опасения рассеялись после появления новых технологий, позволивших передать машинам рутинную работу по определению последовательности. И 1990-е годы вошли в историю как годы уверенного совершенствования возможностей определять последовательность полных геномов.     В 1988 г. средства на изучение генома человека выделило Министерство энергетики, а в 1990 г. — Конгресс США. В Роквилле (штат Мэриленд) появился Национальный институт исследования генома человека (National Human Genome Research Institute, NHGRI), директором которого стал Фрэнсис Коллинз (Francis Collins), и работа над проектом пошла полным ходом.     1995. NHGRI публикует первую полную последовательность ДНК живого организма — бактерии Haemophilus influenzae. За этой бактерий вскоре последовали другие организмы.     1996. Определен первый геном эукариотической клетки (т. е. сложноорганизованной клетки, ДНК которой заключена в ядре) — клетки дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Этим открытием увенчались совместные усилия шестисот ученых из Европы, Северной Америки и Японии.     1998. Опубликована первая последовательность ДНК многоклеточного организма — плоского червя Caenorhabditis elegans.     Число хромосом и их длина различны у разных биологических видов. В клетках бактерий всего одна хромосома. Так, размер генома бактерииMycoplasma genitalium — 0,58 Мб (Мегабаза — от английского слова «base» — основание), у бактерии кишечной палочки Escherichia coli в геноме 4,2 Мб, у растения Arabidopsis thaliana — 100 Мб, у плодовой мушки Drosophila melanogaster — 120 Мб. Самая маленькая хромосома клеток человекаHomo sapiens содержит ДНК длиной 50 Мб, самая большая (хромосома 1) — 250 Мб.     До 1996 г. наибольший участок ДНК, выделяемый из хромосом с помощью реактивов, имел длину 0,35 Мб, а на лучшем оборудовании их структура расшифровывалась со скоростью 0,05–0,1 Мб в год при стоимости $1–2 за основание. Иными словами, только на эту работу понадобилось бы примерно 30 тыс. дней (почти век) и $3 млрд.     Совершенствование технологии к 1998 г. повысило производительность до 0,1 Мб в день (36,5 Мб в год) и понизило стоимость до $0,5 за основание. Использование новых электромеханических устройств, которые к тому же потребляют меньше реактивов, позволило уже в 1999 г. ускорить работы еще в 5 раз и уменьшить стоимость до $0,25 за основание (для человеческой ДНК еще дешевле).     Знаковой фигурой в этом процессе стал Крейг Вентер (Craig Venter), бывший ведущий сотрудник NHGRI, основавший в 1998 г. собственную коммерческую компанию «Силера джиномикс» (Роквилл, штат Мэриленд). В распоряжении Вентера оказался огромный парк компьютеров, который считался тогда вторым по мощности в мире. Триста суперкомпьютеров стоимостью около 80 миллионов долларов круглосуточно обрабатывали огромные объемы данных.     Вентер внедрил в науку метод определения последовательности ДНК, позднее названный «методом беспорядочной стрельбы», который еще называют «методом пулеметной очереди» или «методом стрельбы из дробовика». Суть метода в том, что определяемую ДНК организма разбивают на множество небольших фрагментов, каждый из которых вводят в автомат, определяющий последовательность ДНК. Нечто похожее получится, если разодрать книгу по страницам и раздать их разным читателям. После того как будут определены последовательности каждого фрагмента, в действие вводят сложнейшие компьютерные программы, заново собирающие исходную последовательность. Такое интенсивное использование информационных технологий объясняет, почему многие ученые назвали новую область исследований генома биоинформационной революцией.     К концу 1999 г. было расшифровано свыше двух десятков геномов. Каждое такое достижение требовало определения все более и более длинной последовательности и было важной вехой на пути к определению собственно генома человека.    В июне 2000 года Крейг Вентер и Фрэнсис Коллинз, руководитель проекта «Геном человека» в NHGRI и Национальных институтах здоровья США, объявили о событии, названном ими «первой сборкой генома человека». По существу, это была первая реконструкция полного генома человека, выполненная методом беспорядочной стрельбы.     В феврале 2001 г. Международный консорциум, в который вошли помимо NHGRI и биотехнологической компании «Силера джиномикс», 16 организаций из Великобритании, США, Франции, Германии, Японии и Китая, обнародовали результаты колоссальной работы — первый набросок генома человека.     На протяжении следующих лет различные группы ученых во всем мире постепенно расшифровывали хромосомы человека, периодически сообщая о результатах своей работы. Так, в 2003-м было объявлено о полной расшифровке ДНК, оставалась только первая хромосома человека — последняя из нерасшифрованных хромосом.     И вот, 17 мая 2006 г. исследователи Wellcome Trust Sanger Institute совместно с американскими и английскими коллегами объявили об окончании последнего этапа работы по расшифровке полного генома человека — секвенировании самой большой, первой хромосомы. Об этом сообщается в статье S.G. Gregory et al. «The DNA sequence and biological annotation of human chromosome 1», опубликованной 18 мая в журнале Nature.

   В последовательность 1-й хромосомы входит 223 569 564 нуклеотидных оснований, что составляет около 8% от человеческого генома. Она кодирует в два раза больше генов, чем средняя человеческая хромосома – более 3000 генов, включая те, мутации которых лежат в основе развития более 350 известных заболеваний, в том числе некоторых типов рака, болезней Альцгеймера и Паркинсона, гиперлипидэмии и порфирии. В ходе последнего этапа секвенирования идентифицировано более 1000 новых генов, что должно помочь ученым в разработке новых диагностических тестов и методов терапии различных заболеваний.     По словам доктора Марка Уолпорта (Mark Walport), директора Wellcome Trust, проект «Геном человека» обеспечил исследователей огромным количеством информации о человеческих генах и их возможных вариациях. Эта информация необходима для получения ответов на вопросы о причинах тех или иных состояний человеческого организма.     Весь этот огромный массив информации содержится в многочисленных базах данных и электронных библиотеках со свободным доступом для ученых со всего мира. Этой возможностью последние охотно пользуются, применяя полученные данные в многочисленных исследованиях и проектах, порой самого фантастического толка. Кроме того, в настоящее время с различными прикладными целями активно продолжается расшифровка геномов многих организмов.

СКОЛЬКО ГЕНОВ В ЧЕЛОВЕЧЕСКОМ ОРГАНИЗМЕ?

В любой соматической клетке человека 23 пары хромосом. В каждой из них по одной молекуле ДНК. Длина всех 46 молекул почти 2 м.

У взрослого человека примерно 5х10^13 клеток, так что общая длина молекул ДНК в организме 1011 км (почти в тысячу раз больше расстояния от Земли до Солнца). В молекулах ДНК одной клетки человека 3,2 млрд пар нуклеотидов. Каждый нуклеотид состоит из углевода, фосфата и азотистого основания. Углеводы и фосфаты одинаковы во всех нуклеотидах, а азотистых оснований -- четыре. Таким образом, язык генетических записей четырехбуквенный, и если основание -- его "буква", то "слова" -- это порядок аминокислот в кодируемых генами белках. Кроме состава белков в геноме (совокупности генов в одинарном наборе хромосом) записаны и другие любопытные сведения. Можно сказать, что Природа (в результате эволюции или Божьего промысла) закодировала в ДНК инструкции о том, как клеткам выживать, реагировать на внешние воздействия, предотвращать "поломки", иными словами, -- как развиваться и стареть организму.

Любое нарушение этих инструкций ведет к мутациям, и если они случаются в половых клетках (сперматозоидах или яйцеклетках), мутации передаются следующим поколениям, угрожая существованию данного вида.

Как представить себе 3 млрд оснований зримо? Чтобы воспроизвести информацию, содержащуюся в ДНК единственной клетки, даже самым мелким шрифтом (как в телефонных справочниках), понадобится тысяча 1000-страничных книг!

Сколько же всего генов, то есть последовательностей нуклеотидов, кодирующих белки, в ДНК человека? Года три назад полагали, что около 100 тыс., затем решили, что не более 80 тыс. В конце 1998 г. пришли к выводу, что в геноме человека 50-60 тыс. генов. На их долю приходится только 3% общей длины ДНК. Роль остальных 97% пока не ясна.

ЧТО ТАКОЕ "ГЕНОМ ЧЕЛОВЕКА"?

Цель проекта -- выяснить последовательности азотистых оснований и положения генов (картирование) в каждой молекуле ДНК каждой клетки человека, что открыло бы причины наследственных заболеваний и пути к их лечению. В проекте заняты тысячи специалистов со всего мира: биологов, химиков, математиков, физиков и техников. Это один из самых дорогих научных проектов в истории. В 1990 г. на него потрачено 60 млн долл., в 1991 г. -- 135 млн, в 1992-1995 гг. -- от 165 до 187 млн в год , а в 1996-1998 гг. только США израсходовали 200, 225 и 253 млн

Интерес к уже полученным результатам огромен: самые цитируемые в 1998 г. авторы (не только в генетике или биологии, но во всех областях науки) Марк Адамс и Крэйг Вентер из Института исследований генома в штате Мэриленд (США) -- частной компании, занимающейся только составлением "генных карт".

ВЕХИ ПРОЕКТА

Проект состоит из пяти основных этапов:

· составление карты, на которой помечены гены, отстоящие друг от друга не более, чем на 2 млн оснований, на языке специалистов, с разрешением 2 Мб (Мегабаза -- от английского слова "base" -- основание);

· завершение физических карт каждой хромосомы с разрешением 0,1 Мб;

· получение карты всего генома в виде набора описанных по отдельности клонов (0,005 Мб);

· к 2004 г. полное секвенирование ДНК (разрешение 1 основание);

· нанесение на карту с разрешением в 1 основание всех генов человека (к 2005 г.). Когда эти этапы будут завершены, исследователи определят все функции генов, а также биологические и медицинские применения результатов.

ТРИ КАРТЫ

В ходе проекта создают три типа карт хромосом: генетические, физические и секвенсовые (от англ. sequence -- последовательность). Выявить все гены, присутствующие в геноме, и установить расстояния между ними -- значит локализовать каждый ген в хромосомах. Такие генетические карты помимо инвентаризации генов и указания их положений ответят на исключительно важный вопрос о том, как гены определяют те или иные признаки организма. Ведь многие признаки зависят от нескольких генов, часто расположенных в разных хромосомах, и знание положения каждого из них позволит понять, как происходит дифференцировка (специализация) клеток, органов и тканей, а также как успешнее лечить генетические заболевания. В 20-е и 30-е годы, когда создавалась хромосомная теория наследственности, выяснение положения каждого гена привело к тому, что на генетических картах сначала дрозофилы, а затем кукурузы и ряда других видов удалось отметить особые точки, как тогда говорили, "генетические маркеры" хромосом. Анализ их положения в хромосомах помог снабдить генетические карты хромосом человека новыми сведениями. Первые данные о положении отдельных генов появились еще в 60-е годы. С тех пор они множились лавинообразно, и в настоящее время известно положение уже десятков тысяч генов. Три года назад разрешение генетической карты составляло 10 Мб (для некоторых участков -- даже 5 Мб).

Другое направление исследований -- составление физических карт хромосом. Еще в 60-е годы цитогенетики стали окрашивать хромосомы, чтобы выявить на них особые поперечные полосы. После окрашивания полосы было видно в микроскоп. Между полосами и генами удалось установить соответствие, что позволило изучать хромосомы по-новому. Позже научились "метить" молекулы ДНК (радиоактивными или флуоресцентными метками) и следить за присоединением этих меток к хромосомам, что значительно повысило разрешение их структуры: до 2 Мб, а потом и до 0,1 Мб (при делении клеток).

В 70-е годы научились "разрезать" ДНК на участки специальными (рестрикционными) ферментами, распознающими короткие отрезки ДНК, в которых информация записана в виде палиндромов -- сочетаний, читаемых одинаково от начала к концу и от конца к началу. Так возникли рестрикционные карты хромосом. Использование современных физических и химических методов и средств улучшило разрешение физических карт в сотни раз.

Наконец, разработка методов секвенирования (изучения точных последовательностей нуклеотидов в ДНК) открыла путь к созданию секвенсовых карт с рекордным на сегодня разрешением (на этих картах будет указано положение всех нуклеотидов в ДНК).

ДВА ПОДХОДА

Число хромосом и их длина различны у разных биологических видов. В клетках бактерий всего одна хромосома. Так, размер генома бактерии Mycoplasma genita-lium 0,58 Мб (в нем 470 генов), у бактерии кишечной палочки (Escherichia coli) в геноме 4200 генов (4,2 Мб), у растения Arabi-dopsis thaliana -- 25 тыс. генов (100 Мб), у плодовой мушки Droso-phila melanogaster -- 10 тыс. генов (120 Мб). В ДНК мыши и человека 50-60 тыс. генов (3000 Мб). Конечно, для составления карт столь разных объектов одни и те же методы неприменимы, поэтому используют два разных по методологии подхода. В первом делят ДНК на небольшие куски и, изучив их по отдельности, воссоздают всю структуру, Этот подход увенчался успехом при составлении сравнительно простых карт. Для более сложных геномов эффективнее второй подход. В этих случаях неразумно делить молекулу ДНК на короткие куски, удобные для детального изучения. Их оказалось бы так много, что путаница в последовательностях была бы неразрешимой. Поэтому, принимаясь за расшифровку, молекулу делят, наоборот, на как можно более длинные куски и сравнивают их в надежде найти общие концевые участки. Если это удается, куски объединяют, после чего процедуру повторяют. С совершенствованием компьютеров и математических методов обработки информации объединенные по такому принципу куски становятся все крупнее, постепенно приближаясь к целой молекуле. Этот подход, в частности, позволил составить генетическую карту 3-й хромосомы дрозофилы.

КЛАДЕЗЬ НОВЫХ ТЕХНОЛОГИЙ

Важный аспект проекта "Геном человека" -- разработка новых методов исследований. Еще до старта проекта был развит ряд весьма эффективных методов цитогенетических исследований (теперь их называют методами первого поколения). Среди них: создание и применение упомянутых рестрикционных ферментов; получение гибридных молекул, их клонирование и перенос участков ДНК с помощью векторов в клетки-доноры (чаще всего -- кишечной палочки или дрожжей); синтез ДНК на матрицах информационной РНК; секвенирование генов; копирование генов с помощью специальных устройств; способы анализа и классификации молекул ДНК по плотности, массе, структуре.

В последние 4-5 лет благодаря проекту "Геном человека" разработаны новые методы (методы второго поколения), в которых почти все процессы полностью автоматизированы. Почему это направление стало центральным? Самая маленькая хромосома клеток человека содержит ДНК длиной 50 Мб, самая большая (хромосома 1) -- 250 Мб. До 1996 г. наибольший участок ДНК, выделяемый из хромосом с помощью реактивов, имел длину 0,35 Мб, а на лучшем оборудовании их структура расшифровывалась со скоростью 0,05-0,1 Мб в год при стоимости 1-2 долл. за основание. Иными словами, только на эту работу понадобилось бы примерно 30 тыс. дней (почти век) и 3 млрд долл.

Совершенствование технологии к 1998 г. повысило производительность до 0,1 Мб в день (36,5 Мб в год) и понизило стоимость до 0,5 долл. за основание. Использование новых электромеханических устройств, которые к тому же потребляют меньше реактивов, позволит уже в 1999 г. ускорить работы еще в 5 раз (к 2003 г. планируется довести скорость расшифровки до 500 Мб в год) и уменьшить стоимость до 0,25 долл. за основание (для человеческой ДНК еще дешевле).

ГЕНЫ В БАНКЕ

За последние шесть лет созданы международные банки данных о последовательностях нуклеотидов в ДНК разных организмов (GenBank / EMBL / pBJ) и о последовательностях аминокислот в белках (PIR / SwissPot). Любой специалист может воспользоваться собранной там информацией в исследовательских целях. Решение о свободном доступе к информации далось нелегко. Ученые, юристы, законодатели немало потрудились, чтобы воспрепятствовать намерениям коммерческих фирм патентовать все результаты проекта и превратить эту область науки в бизнес.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Расшифрованные геномы 1995 г. -- бактерия Hemophilus influenza; 1996 г. -- клетка дрожжей (6 тыс. генов, 12,5 Мб); 1998 г. -- круглый червь Caenorhabditis elegans (19 тыс. генов, 97 Мб). Основные результаты завершенных этапов проекта изложены в журнале "Science" (1998. Vol. 282, № 5396,. Р. 2012-2042).

Изученные гены человека. За 1995 г. длина участков ДНК человека с установленной последовательностью оснований увеличилась почти в 10 раз. Но хотя прогресс был налицо, результат за год составил менее 0,001% от того, что предстояло сделать. Но уже к июлю 1998 г. было расшифровано почти 9% генома, а затем каждый месяц появлялись новые значительные результаты. Изучив большое число копий генов в виде сДНК и сопоставив их последовательности с участками хромосомной ДНК, к ноябрю 1998 г. расшифровали 30 261 ген (примерно половина генома).

Функции генов. Результаты завершенной части проекта позволяют судить о роли двух третей генов в образовании и функционировании органов и тканей человеческого организма. Оказалось, что больше всего генов нужно для формирования мозга и поддержания его активности, а меньше всего для создания эритроцитов -- лишь 8.

Другие организмы. Когда составлялась программа исследований по проекту, решили сначала отработать методы на более простых моделях. Поэтому на первом этапе реализации проекта изучили 8 разных представителей мира микроорганизмов, а к концу 1998 г. -- уже 18 организмов с размерами генома от 1 до 20 Мб. В их числе представители многих родов бактерий: архебактерии, спирохеты, хламидобактерии, кишечная палочка, возбудители пневмоний, сифилиса, гемофилии, метанобразующие бактерии, микоплазмы, риккетсии, цианобактерии. Как уже упоминалось, завершен генетический анализ одноклеточного эукариота -- дрожжей Saccharomy-ces cerevisae и первого многоклеточного животного -- червя C. elegans.

Повреждения генов и наследственные болезни. Из 10 тыс. известных заболеваний человека около 3 тыс. -- наследственные болезни. Они необязательно наследуются (передаются потомкам). Просто вызваны они нарушениями наследственного аппарата, то есть генов (в том числе в соматических клетках, а не только в половых). Выявление молекулярных причин "поломки" генов -- важнейший результат проекта. Число изученных болезнетворных генов быстро растет, и через 3-4 года мы познаем все 3 тыс. генов, ответственных за те или иные патологии. Это поможет разобраться в генетических программах развития и функционирования человеческого организма, в частности, понять причины рака и старения. Знание молекулярных основ заболеваний поможет их ранней диагностике, а значит, и более успешному лечению. Адресное снабжение лекарствами пораженных клеток, замена больных генов здоровыми, управление обменом веществ и многие другие мечты фантастов на наших глазах превращаются в реальные методы современной медицины.

Молекулярные механизмы эволюции. Зная строение геномов, ученые приблизятся к разгадке механизмов эволюции. В частности, такого ее этапа, как деление живых существ на прокариоты и эукариоты. До последнего времени к прокариотам относили архебактерии, по многим признакам отличающиеся от других представителей этой группы микроорганизмов, но также состоящие всего из одной клетки без обособленного ядра, но с молекулой ДНК в виде двойной спирали. Когда год назад геном архебактерий расшифровали, стало ясно, что это отдельная ветвь на эволюционном древе.

ЗАДАЧИ НА БУДУЩЕЕ

С учетом постоянного наращивания темпов работ руководители проекта заявили в конце 1998 г., что проект будет выполнен гораздо раньше, чем планировалось, и сформулировали задачи на ближайшую перспективу:

2001 г. -- предварительный анализ генома человека; 2002 г. -- расшифровка генома плодовой мухи Drosophila melanogaster; 2003 г. -- создание полных карт генома человека; 2005 г. -- расшифровка генома мыши с использованием методов с ДНК и искусственных хромосом дрожжей.

Помимо этих целей, официально включенных в международный проект, поддерживаемый США и рядом других стран на правительственном уровне, некоторые исследовательские центры объявили о задачах, которые будут решаться в основном за счет грантов и пожертвований. Так, ученые Калифорнийского университета (Беркли), Орегонского университета и Центра Ф.Хатчинсона по исследованию рака начали расшифровку генома собаки.

ЧТО ДАЛЬШЕ?

Главная стратегическая задача на будущее -- изучить вариации ДНК (на уровне отдельных нуклеотидов) в разных органах и клетках отдельных индивидуумов и выявить эти различия. Обычно одиночные мутации в ДНК человека встречаются в среднем на тысячу неизмененных оснований. Анализ таких вариаций позволит не только создавать индивидуальные генные портреты и тем самым лечить любые болезни, но и определять различия между популяциями и регионы повышенного риска, делать заключения о необходимости первоочередной очистки территорий от тех или иных загрязнений и выявлять производства, опасные для геномов персонала. Впрочем, наряду с радужными ожиданиями всеобщего блага эта грандиозная цель вызывает и вполне осознанную тревогу юристов и борцов за права человека. В частности, высказываются возражения против распространения генетической информации без разрешения тех, кого она касается. Ведь ни для кого не секрет, что уже сегодня страховые компании стремятся добыть такие сведения всеми правдами и неправдами, намереваясь использовать эти данные против тех, кого они страхуют. Компании не желают страховать клиентов с потенциально болезнетворными генами или заламывают за их страховки бешеные суммы. Поэтому конгресс США уже принял ряд законов, направленных на строгий запрет распространения индивидуальной генетической информации.

Билет 4 1. Закон независимого наследования признаков в работах г. Менделя (III закон Менделя). Условия выполнения и нарушение закона. Закон независимого наследования признаков

[править]Определение

Закон независимого наследования (третий закон Менделя) — при скрещивании двух гомозиготных особей, отличающихся друг от друга по двум (и более) парам альтернативных признаков, гены и соответствующие им признаки наследуются независимо друг от друга и комбинируются во всех возможных сочетаниях (как и при моногибридном скрещивании). Когда скрещивались растения, отличающиеся по нескольким признакам, таким как белые и пурпурные цветы и желтые или зелёные горошины, наследование каждого из признаков следовало первым двум законам и в потомстве они комбинировались таким образом, как будто их наследование происходило независимо друг от друга. Первое поколение после скрещивания обладало доминантным фенотипом по всем признакам. Во втором поколении наблюдалось расщепление фенотипов по формуле 9:3:3:1, то есть 9:16 были с пурпурными цветами и желтыми горошинами, 3:16 с белыми цветами и желтыми горошинами, 3:16 с пурпурными цветами и зелёными горошинами, 1:16 с белыми цветами и зелёными горошинами.

Менделю попались признаки, гены которых находились в разных парах гомологичных хромосом гороха. При мейозе гомологичные хромосомы разных пар комбинируются в гаметах случайным образом. Если в гамету попала отцовская хромосома первой пары, то с равной вероятностью в эту гамету может попасть как отцовская, так и материнская хромосома второй пары. Поэтому признаки, гены которых находятся в разных парах гомологичных хромосом, комбинируются независимо друг от друга. (Впоследствии выяснилось, что из исследованных Менделем семи пар признаков у гороха, у которого диплоидное число хромосом 2n=14, гены, отвечающие за одну из пар признаков, находились в одной и той же хромосоме. Однако Мендель не обнаружил нарушения закона независимого наследования, так как сцепления между этими генами не наблюдалось из-за большого расстояния между ними).

Билет 6 1. Цитогенетический метод. Кариотип человека. Хромосомные нарушения. Цитогенетический метод

Теоретическая часть. Цитологический метод основан на микроскопическом изучении хромосом в клетках человека. Цитогенетический метод широко применяется с 1956 года, когда Дж. Тио и Л. Леван установили, что в кариотипе человека 46 хромосом.

Цитогенетический метод основывается на данных о хромосомах. В 1960 году на научной конференции в Денвере была принята классификация идентифицируемых хромосом, в соответствии с которой им были даны номера, увеличивающиеся по мере уменьшения размеров хромосом. Эта классификация была уточнена на конференции в Лондоне (1963) и Чикаго (1966).

Применение цитогенетического метода позволяет изучать нормальную морфологию хромосом и кариотипа в целом, определять генетический пол организма, и, главное, диагностировать различные хромосомные болезни, связанные с изменением числа хромосом или с нарушением структуры хромосом. Цитогенетический метод позволяет изучать процессы мутагенеза на уровне хромосом и кариотипа. Метод широко применяется в медико-генетическом консультировании для целей пренатальной диагностики хромосомных болезней.

В соматических клетках человека диплоидный набор хромосом, 2n=46, а в половых – гаплоидный n=23. При оплодотворении диплоидный набор хромосом восстанавливается.

В хромосоме выделяют короткое (р) и длинное (q) плечи. Концы обоих плеч хромосомы называют теломерами. В метафазе митоза хромосомы представлены двумя сестринскими хроматидами, соединенными центромерой. В центромере содержится вещество – кинетохор, участвующее в формировании нитей веретена при клеточном делении.

При изучении кариотипа определяют следующие морфометрические характеристики хромосом: L^а – абсолютная длина хромосомы в мкм; L^р – длина короткого плеча; L^g – длина длинного плеча. I^в – плечевой индекс, I^с – центромерный индекс, L^r – относительная длина хромосомы, I^h - процент гетерохроматиновой зоны, I^s – индекс спирализации.

По значению плечевого индекса определяется форма хромосом. При I^в 1-1,9 хромосома называется равноплечей (метацентрической), 2-4,9 – слабонеравноплечей (субметацентрической), 5 и более – акроцентрической или резко неравноплечей.

Для кариотипирования подбирают метафазные пластинки в количестве не менее 30 с одинаковым индексом спирализации.

На основании различий в длине выделены 23 пары хромосом. По форме в кариотипе человека имеются метацентрические, субметацентрические и акроцентрические хромосомы. Отнесение хромосом к той или иной группе производится на основе расчета центромерного индекса. На основании размеров и комбинации плечевого и центромерного индексов хромосомы человека в соответствии с Международной Денверской классификацией (1960) сгруппированы в 7 групп, обохзначаемых буквами английского алфавита: A, B, C, D, E, F, G.

Таблица 1 Международная денверская классификация хромосом человека (1960г.)

Группа	Номер пары хромосом	Центромерный индекс	Размеры и форма хромосом
A	1	0,48-0,49	Самые крупные, метацентрики
	2	0,38-0,40	Самые крупные, метацентрики
	3	0,45-0,46	Самые крупные, метацентрики
B	4,5	0,24-0,30	Крупные, субметацентрики
C	6-12 Х - хромосома	0,28-0,43	Среднего размера, метацентрики и субметацентрики. Группа включает 7 аутосом и Х-хромосому
D	13, 14, 15	до 0,15	Среднего размера, акроцентрики, характерна межиндивидуальная вариабельность и наличие спутников на коротких плечах
E	16-18	0,26-0,40	Относительно короткие метацентрики и субметацентрики
F	19,20	0,36-0,46	Небольшие метацентрики
G	21,22 Y - хромосома	0,13-0,33	Небольшие акроцентрики. Для аутосом характерно наличие спутников не коротких плечах

В настоящее время для идентификации хромосом в соответствии с номенклатурой ISCN-1995 (парижская номенклатура) все чаще используется дифференциальное окрашивание, которое на хромосомах дает полосы поперечной исчерченности, благодаря которым можно более точно идентифицировать пары гомологов.

Анализ кариотипа проводят в культуре делящихся соматических и половых клеток. Наиболее часто используют культуру клеток переферической крови, прежде всего лимфоцитов, костного мозга и фибробластов. Для анализа кариотипа плода используют различные клеточные культуры; их выбор определяется сроком беременности (до 12 недель – используют клетки ворсин хориона, в более поздние сроки – клетки плода, выделенные из амниотической жидкости, пуповинной крови и плаценты).

Цитологический анализ включает три основынх этапа:

1. Культивирование клеток;

2. Окраска препарата;

3. Микроскопический анализ препарата.

Культивирование.Образец помещают в питательную солевую среду с добавлением цельной сыворотки крупного рогатого скота и белка бобовых растений – фитогемагглютинина, стимулирующего процесс деления клеток. Для увеличения числа метафазных клеток (кариотип изучают в метафазных клетках, где хромосомы достигают наибольшей спирализации и наиболее четко проявляется их форма) за 1,5 часа до окончания культивирования в культуру вводят колхицин (C₂₂H₂₅NO₆), который разрушает клеточное веретено, приостанавливает деление клеток на стадии метафазы и увеличивает конденсацию (спирализацию) хромосом. Обычно культивирование составляет 72 часа. После этого клетки отделяют центрифугированием и помещением в гипотонический раствор хлорида калия или цитрата натрия. В гипотонической среде происходит разрыв ядерной оболочки и межхромосомных связей и хромосомы свободно перемещаются в цитоплазму. Затем производится фиксация клеток в фиксаторе Карнуа (3:1): 3 части составляет 96% этиловый спирт ректификат, 1 часть ледяная уксусная кислота.

После фиксации клеточную суспензию раскладывают на обезжиренные, охлажденные влажные предметные стекла и высушивают на воздухе.

Окраска. Наиболее простой метод окраски хромосом – это сплошная по Гимза. Сплошная окраска применяется для определения количества хромосом, выявления геномных мутаций и анеуплоидии.

Для выявления структурной перестройки хромосом (хромосомные мутации) используют дифференциальную окраску, в результате которой хромосомы приобретают поперечную исчерченность. Расположение и длина темных и светлых полос строго индивидуальна для каждой хромосомы, благодаря этому можно провести более точную идентификацию гомологичных пар и выявить перестройки хромосом.

Наиболее эффективен G-метод дифференциального окрашивания, для этого можно использовать краситель Гимзы, после предварительной обработки хромосом раствором трипсина. При таком окрашивании количество полос на хромосомах в метафазных пластинках достигает 400. Для дифокраски используют также R-метод, и Q-метод. После окраски объект заключают в Канадский бальзам, препарат становится постоянным и может храниться десятки лет.

Микроскопирование препаратов метафазных хромосом. Для описания кариотипа человека используется универсальная схема и специальные символы. Например, запись 46,хх – обозначает нормальный кариотип женщины, а 46, ху – нормальный кариотип мужчины.

В ряде случаев при изучении хромосом обнаруживают полиморфизм, который наиболее характерен для акроцентрических хромосом и, как правило, отражает вариабельность размеров гетерохроматиновых сегментов, наличие спутников, спутничных нитей в области коротких плеч и их величину. В таблице 2 приведены некоторые из них.

Таблица 2 Обозначение полиморфизма хромосом человека

Символы кариотипа	Тип хромосомной перестройки
46,ХХ,9qh+	Увеличение размера гетерохроматинового участка в длинном плече хромосомы 9 женщины
46,XY,Yqh-	Уменьшение размера гетерохроматинового района на длинном плече Y хромосомы у мужчины
46, XX,22ps+	Увеличение размера спутников на коротком плече хромосомы 22 у женщины
46,XY,21pstk	Увеличение длины спутничных нитей на коротком плече хромосомы 21 у мужчины
46,XX,fra(16)(q21.3)	Ломкий сайт в сегменте 21 длинного плеча хромосомы 16
46,XX,15pss	Появление двойных спутников на коротком плече хромосомы 15 у женщины
46,XX,21ps+	Увеличение размера спутников на коротком плече хромосомы 21 у женщины

Установлено, что наличие нормального полиморфизма хромосом увеличивает риск рождения ребенка с хромосомными аномалиями.

Среди супружеских пар, у которых наблюдалось рождение детей с пороками развития, а также страдающих бесплодием и привычным невынашиванием беременности, чаще выявляется носительство хромосом с крупными гетерохроматиновыми блоками. Преобладание лиц с увеличенными гетерохроматиновыми сегментами в акроцентрических хромосомах, а также в хромосомах 1, 9 и 16 отмечено в группе детей с множественными врожденными пороками развития.

Следуя рекомендациям IV Международного конгресса по генетике человека в Париже (1971), при описании добавочных хромосом их номер помещают после общего числа аутосом и половых хромосом со знаком «плюс» или «минус» перед номером вовлеченной аутосомы. Например, запись (формула) 47,ХХ+21 обозначает кариотип женщины с трисомией по 21 паре хромосом. Напротив, кариотип мужчины с экстрахромосомой Х изображают как 47,ХХY. Знак «плюс» или «минус» ставят после символа хромосомы, чтобы указать удлинение или укорочение ее плеча. Буква q символизирует длинное плечо, а p – короткое. Например, запись 46,ХY,1q+ указывает на увеличение длинного плеча хромосомы 1. Формула 47,ХY+14р+ - кариотип мужчины с 47 хромосомами, включая и дополнительную хромосому 14 с удлинением ее короткого плеча.

Сокращение – def (дефишенс), dup (дупликация), r (кольцо, возникающее после воссоединения двух разрывов в хромосоме), inv (инверсия) и t (транслокация) – обозначают аберрации хромосом. Номера хромосомы или хромосом помещают после сокращений в скобках. Например, запись 46,ХХ,r(18) означает кариотип женщины с 46 хромосомами, включая r-хромосому 18. Формула 46,Х,inv(Хq) – кариотип женщины с 46 хромосомами, включая одну нормальную Х-хромосому и изохромосому Х (с двумя генетически идентичными длинными плечами). Банды помечаются числами по мере удаления от центромеры вдоль короткого (р) и длинного (q) плечей хромосомы.

С помощью цитогенетического метода выявлены хромосомные мутации типа реципрокных транслокаций, робертсоновских транслокаций и делеций. Так, транслокация 21-й хромосомы на другую 21, 22, 13, 14 или 15 вызывает синдром Дауна. Так, делеция короткого плеча Х-хромосомы (трактуется как моносомия по Х-хромосоме) укорочение короткого плеча 21-й хромосомы (филадельфийская хромосома), делеция короткого плеча хромосомы 5-й пары (синдром «кошачьего крика»), делеция длинного и короткого плеча 18-й хромосомы (нарушение строения лица, скелета, умственная отсталость, гипотрофия, гипотония и многие другие аномалии). В результате двух концевых нехваток образуются кольцевые хромосомы. При кольцевой 5-й хромосоме развивается синдром «кошачьего крика», в х-хромосоме – клиническая картина близка синдрому Шерешевского-Тернера. Среди геномных мутаций наиболее часто встречается синдром Дауна (трисомия по 21 паре). Трисомия по 13 хромосоме вызывает синдром Патау, по 18 хромосоме – синдром Эдвардса. Среди анеуплоидных синдромов по половым хромосомам (ХО) – синдром Шершевского-Тернера. Полисомия по Х хромосоме называется синдром Клайнфельтера (ХХY), встречаются отклонения по числу половых хромосом (ХХХY, XYY и др.) и синдром ТриплоХ.

Метод определения полового хроматина. Это экспресс метод, позволяющий выявить изменения числа половых хромосом в неделящихся клетках слизистой оболочки щеки. Половой хроматин, или тельце Барра, образуется одной из хромосом женского организма. Оно выглядит как интенсивно окрашенная глыбка, расположенная вблизи ядерной оболочки. При увеличении количества Х-хромосом в кариотипе организма образуются тельца Барра в количестве на единицу меньше числа Х-хромосом. При моносомии по Х-хромосоме тельце Барра отсутствует. Y-хромосома в мужском кариотипе обнаруживается по более интенсивной люминисценции при обработке акрихинипритом и излучении в ультрафиолетовом свете.

2. Задача Бомбейская группа крови зависит от редкого эпистатического рецессивного гена s, который в гомозиготном состоянии ss препятствует образованию антигенов А и В. В результате индивиды, гомозиготные по этому гену, будут иметь группу крови О. Определите вероятность рождения детей с I группой крови, если родители имеют IV группу крови (АВ) и гетерозиготны по эпистатическому гену (гетерозигота Ss). БИЛЕТ 7 Близнецовый метод

1 — монозиготные близ­нецы; 2 — дизигот­ные близ­нецы.

Близнецами называют одновременно родившихся детей. Они бывают монозиготными (однояйцевыми) идизиготными (разнояйцевыми).

Монозиготные близнецы развиваются из одной зиготы (1), которая на стадии дробления разделилась на две (или более) части. Поэтому такие близнецы генетически идентичны и всегда одного пола. Монозиготные близнецы характеризуются большой степенью сходства (конкордантностью) по многим признакам.

Дизиготные близнецы развиваются из двух или более одновременно овулировавших и оплодотворенных разными сперматозоидами яйцеклеток (2). Поэтому они имеют различные генотипы и могут быть как одного, так и разного пола. В отличие от монозиготных, дизиготные близнецы характеризуются дискордантностью — несходством по многим признакам. Данные о конкордантности близнецов по некоторым признакам приведены в таблице.

Признаки	Конкордантность, %
	Монозиготные близнецы	Дизиготные близнецы
Нормальные
Группа крови (АВ0)	100	46
Цвет глаз	99,5	28
Цвет волос	97	23
Патологические
Косолапость	32	3
«Заячья губа»	33	5
Бронхиальная астма	19	4,8
Корь	98	94
Туберкулез	37	15
Эпилепсия	67	3
Шизофрения	70	13

Как видно из таблицы, степень конкордантности монозиготных близнецов по всем приведенным признакам значительно выше, чем у дизиготных, однако она не является абсолютной. Как правило, дискордантность монозиготных близнецов возникает в результате нарушений внутриутробного развития одного из них или под влиянием внешней среды, если она была разной.

Благодаря близнецовому методу, была выяснена наследственная предрасположенность человека к ряду заболеваний: шизофрении, эпилепсии, сахарному диабету и другим.

Наблюдения за монозиготными близнецами дают материал для выяснения роли наследственности и среды в развитии признаков. Причем под внешней средой понимают не только физические факторы среды, но и социальные условия.