Тема: «определение сиаловых кислот в сыворотке крови методом гесса».

Метод Гесса колориметрический, основан на цветной реакции, получаемой при нагревании сиаловой кислоты (ацетилнейраминовой) с уксусно-сернокислотным реактивом. Интенсивность буровато-розового окрашивания зависит от концентрации сиаловых кислот.

Исследования сиаловых кислот в крови имеет важное диагностическое значение, особенно при ревматизме, туберкулезе и раке легких, злокачественных опухолях костной ткани, когда содержание их увеличивается.

ИССЛЕДУЕМЫЙ МАТЕРИАЛ: Сыворотка крови.

РЕАКТИВЫ: 1) Трихлоруксусная кислота, 10%-ный раствор. 2) Уксусно-сернокислотный реактив (95 частей ледяной уксусной кислоты и 5 частей концентрированной серной кислоты).

ОБОРУДОВАНИЕ: 1) Водяная баня. 2) Фотоэлектроколориметр. 3) Центрифуга, центрифужные пробирки.

ХОД РАБОТЫ.

К 1 мл сыворотке крови в центрифужной пробирке добавляют 1 мл 10% раствора трихлоруксусной кислоты и встряхивают (при этом образуется осадок). Затем центрифужную пробирку помещают в кипящую водяную баню на 5 минут и охлаждают. Это приводит к освобождению связей N-ацетилнейраминовой кислоты с белковой частью молекулы гликопротеидов. Центрифугируют при 3000 оборотах в минуту 10 минут. После центрифугирования к 0,4 мл (8 капель) надосадочной жидкости добавляют 5 мл уксусно-кислотного реактива и повторно нагревают в кипящей водяной бане в течение 30 минут. При этом появляется буровато-розовое окрашивание. После охлаждения колориметрируют в фотоэлектроколориметре в кювете 10 мм с зеленым (540) светофильтром по правому барабану. Полученную величину экстинции умножают на 1000. Результат определения выражают в величинах экстинции. В норме величина её (ФЭК) колеблется от 100 до 195, что соответствует содержанию сиаловых кислот от 50 до 79 мг %. Метод прост и быстр, более специфичен, чем дифениламиновый, но малочувствителен.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №18.

Тема: «определение перекиси липидов в тесте с тиобарбитуровой кислотой».

При высокой температуре в кислой среде малоновый диальдегид (МДА) реагирует с 2 тиобарбитуровой кислотой (ТБК), образуя окрашенный триметиновый комплекс, содержащий 1 молекулу МДА и 2 молекулы ТБК, с максимумом поглощения при 535 нм.

ИССЛЕДУЕМЫЙ МАТЕРИАЛ: Сыворотка крови.

РЕАКТИВЫ: 1) Ортофосфорная кислота (1%-ый раствор). 2) 2-тиобарбитуровая кислота (0,6%-ный раствор). 3) Железо сернокислое FeSO₄ • 7 H₂O (1 мкмоль в пробе). 4) Бутиловый спирт (бутанол-1, н-бутиловый спирт).

ОБОРУДОВАНИЕ: 1) Пробирки центрифужные. 2) Прибор для отсасывания верхней фазы 1 шт.

Ход работы.

К 0,3 мл (6 капель) сыворотки приливают 3 мл 1%-ного раствора ортофосфорной кислоты, добавляют 1 мл 0,6%-ного раствора ТБК и 0,1 мл (2 капли) раствора сернокислого железа. Перемешивают. Пробирки закрывают пробкой, ставят в кипящую водяную баню на 1 час.

Затем пробирки охлаждают в холодной воде, добавляют 4 мл бутанола, тщательно перемешивают и центрифугируют 10 минут при 3000 оборотах в минуту. Измеряют оптическую плотность верхней фазы при длине волны 535 нм (Еоп) против бутанола.

Расчет содержания продуктов (МДА), реагирующих с ТБК, проводят по формуле:

Еоп  10⁶  4 мл

А = —————————————————— = Еоп  85,47 мкмоль/л,

1,56  10⁵ (л/моль  см)  1 см  0,3 мл

где А – содержание МДА в мкмоль/л;

4 мл – объём бутанольной фазы;

0,3 мл – объём сыворотки;

1,56  10⁵ л/моль  см – коэффициент молярной экстинции МДА;

1 см – толщина слоя кюветы;

10⁶ - коэффициент перевода моль в мкмоль.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 19.

Тема: «ОПРЕДЕЛЕНИЕ КАЛЬЦИЯ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ