7. Источники лактопероксидазы в животном организме. Содержание ее в молочном сырье.

Лактопероксидаза-основной фермент коровь­его молока, катализирующий инактивацию микроорганизмов в Л системе, они являются природными антимикробными системами в таких человеческих секрециях, как слюна, слеза и молоко, притом совершенно без­вредны для организма млекопитающих. Л не обладает бактерицидным действием..Для того чтобы она начала работать необходимо присут­ствие двух ко-факторо - перекиси водо­рода и ионов галогенов или псевдогалогенов'|Концентрация в коровьем молоке приблизительно равна 30 мг/л, состав­ляет около 0,5 % от всех сывороточных бел­ков молока

Литературные данные об активности белка сильно отличаются друг от друга из-за разли­чия экспериментальных условий и субстрата, применяемого при измерении активности. Наиболее чувствительным и широко используе­мым в наши дни для определения ферментативной активности является суб­страт ABTS.

Содержание фермента в мол. непостоянно и зависит периода лактации, времени года, корм­ления и породы животного. Она инактиви­руется при нагревании более 76^оС 120с-используется для проверки эф-ти пасте­риз. И снижается при повышении pH оптим для Л – 5-6

8. Содержание лактопероксидазы в молочных продуктах широкого потребления. Использова­ние ее в технологических процес­сах переработки молочного сырья.

Тк она инактивируется при нагревании более 76^оС 120с. и повышении pH Она-использу­ется для проверки эф-ти пастериз.и ее следы находят в твороге, домашнем сыре, творож­ной сыв., сыре и подсырной сыв.

9. Методы определения концентрации лакто­феррина в молочном сырье.

Определяется с помощью методов: ИФА-им­мунно-ферментативной анализ, хроматографи­ческий анализ, в чистых р-рах- спектрометрия, осаждение кисло­той/щелочью-высаливание, катионно-обмен­ная хроматография

10. Методы определения концентрации лактопе­роксидазы в молочном сырье.

Метод основан на свойстве лактопероксидазы катализировать окисление перекисью водо­рода фенолов, ароматических аминов и дру­гих соединений. В качестве субстрата в описы­ваемом варианте метода используется диаммониевая соль 2,2' - азино-ди 3-этил -2,3-дигидробензотиазолин-сульфоновой кислоты (ABTS).

При анализе цел.мол. на содержание лактопе­роксидазы, необходимо его предварительно обезжирить центрифугированием и осадить казеин добавлением смеси 10%-й уксусной кислоты с 1М ацетатом натрия. Осадок отфильт­ровывают через бум. фильтр, а в сыво­ротке определяют активность лактоперок­сидазы.

В пробирку объемом 10 см³ вносят 2,7см³ 0,1M фосфатного буфера (рН 6,4), 150 -10^-3 см³ 1О мМ раствора Н₂О2, +150*10^-3 10 мМ раствора ABTS. Смесь перемешивают на ме­шалке Оставляют смесь до достижения комнат­ной, перелить в кювету спектрофото­метра (толщина слоя 1 см). Реакцию иниции­руют добавлением в кювету 10 10^-3 см³ иссле­дуемого образца. Измеряют оптическую плот­ность за 3 мин опытной пробы по отноше­нию к контрольной пробе при длине волны 436 им. Контрольную пробу готовят как и опытную, но вместо исследуемой жидко­сти к реакционной смеси добавляют 10*10 ^-3 см³ дистиллированной воды. Оптиче­скую плотность измеряют с 30-ти секундным интервалом в течение 3-х минут. Если отсутст­вует автоматическая запись динамики процесса, строят график зависимости оптиче­ской плотности от времени реакции. Опреде­ляют изменение реакционной смеси за I ми­нуту (ΔD436 /мин), используя начальную часть линейного участка кривой. Активность фермента рассчитывают по формуле: A=ΔD₄₃₆/E, А - активность фермента, выражен­ная в международных единицах, мкмоль/миН'См³;ΔD₄₃₆ - изменение опт. Плот. за 1 мин. при длине волны 436 нм;Е – коэф. экстинкции субстрата, который для ABTS при длине волны 436 нм равен 29500 л/моль.При расчете величины активности л.. анализ. образца учитывается:1)разведение пробы. А_исх.=А_разв.n,где А_исх.-фермент. актив­ность исходного анализируемого об­разца;А_разв.- ферментативная активность разве­денного в п раз раствора.

Для определ. содержание лактопероксидазы в анализируемом: образце, необходимо иметь чистый препарат фермента. Если в инструк­ции к коммерческому препарату указано, что активность лактопероксидазы проводилась с использованием ABTS, пересчет можно произ­вести с учетом данных, приведенных в инструкции (вес препарата лактопероксидазы и его активность в международных едини­цах). Если активность коммерческого препа­рата лактопероксидазы определена с использо­ванием другого субстрата, необхо­димо построить калибровочный график, исполь­зуя чистый препарат лактоперокси­дазы в качестве стандарта. Для построения калибровочной кривой готовят растворы лакто­пероксидазы на дистиллированной воде с различной концентрацией (5, 10, 15, 20, 25, 30 мкг/см). Определение активности лактопе­роксидазы стандартных растворов проводят, как описано выше. Калибровочный график строят, откладывая на оси абсцисс концентра­цию используемых стандартных растворов лактопероксидазы, а на оси ординат - соответст­вующие им значения А в мкмоль/мин –см^3.