Биоспецифическая хроматография.

Сущность метода биоспецифической хроматографии состоит в том, что между одним или ограниченным числом белков-ферментов из множества имеющихся в фракционируемой смеси и полимерным сорбентом образуется довольно стабильная связь, в результате чего эти белки из раствора переходят на нерастворимый сорбент, что повышает его селективность.

Высокая селективность биоспецифических сорбентов обеспечивается тем, что в качестве лигандов используются вещества, специфически взаимодействующие с активным центром выделяемого фермента. Центром связывания служат присоединительные к полимерным матрицам субстраты, их аналоги, обратимые ингибиторы, коферменты, антитела и другие вещества, обычно называемые лигандами.

Таблица Примеры сродства биологических молекул

Очищенные препараты	Лиганды
Ферменты	Субстратный аналог, ингибитор, антиген, вирус, антитела
Гормоны, витамины	Рецептор, белок-переносчик

Вторым компонентом биоспецифического сорбента является полимерная матрица, к которой присоединяется лиганд. Матрицей может быть любой полимер, в той или иной степени удовлетворяющий следующим требованиям:

— крупнопористость гелевой структуры;

—  гидрофильность, обеспечивающая хорошее взаимодействием  ее с водой и отсутствие неспецифического связывания белков  гидрофобным центрам;

— отсутствие в структуре заряженных групп;

— способность полимера легко активироваться определенным химическими агентами,

Указанным требованиям отвечают: синтетические полимеры  полиакриламиды, сфероны, а также крупнопористое стеклосиликагели,

Обычно хроматографический процесс состоит из последовтельно меняющихся этапов сорбции, удаления несорбированным белков и элюации сорбированных ферментов.

Большие перспективы открывает использование моноклоналных антител для приготовления аффинный гелей. Достаточно 4,0—5,0 антител, чтобы приготовить 1 л аффинного геля. Такие гели успешно применяют для выделения из среды культивиро вания животных клеток, например, гормона роста человека – самототропина и интерферона.

Направленный синтез биоспецифически сорбентов и выбор режимов аффинной хроматографии позволяет добиться таких высоких степеней очистки БАВ, которые недостижимы для других хроматографических приемов. За одну стадию степень очистки может достигать 10²—10³ раз.

По своей природе аффинная хроматография является вариантом адсорбционной хроматографии и ее основные закономерности близки обратнофазной и другим видам адсорбционной хроматографии. Используя уравнение

V_e=K_dV_p + V₀ =_УрЩ ₊ У₀, ^KD

можно показать, что удерживание БАВ происходит только при условии [Р₀] > Кр, когда концентрация иммобилизованного аффината [Р₀] больше константы диссоциации комплекса фермент—аффинат, например, относительное удерживание V_e =V₀ ?= 10 при [Р₀] = 1 ммоль/л возможно при величинеконстанты диссоциации K_D ~ 10^-4моль/л. Очевидно, что при использовании аффинатов с большей величиной K_D необходимо повышать концентрацию иммобилизованного аффината. Наоборот, при использовании аффинатов с очень малыми величинами K_D можно получить эффективно удерживающие сорбенты даже при небольших концентрациях аффинатов.