Определение коагулазоположительных Staphylococcus aureus

Метод основан на способности микроорганизмов рода Staphylococcus расти на средах с повышенным содержанием хлорида натрия.

При этом среди всех представителей данного рода и вида наибольшее санитарно-микробиологическое (санитарно-гигиеническое) значение имеет обнаружение коагулазоположительных S.аureus – стафилококков, способных коагулировать цитратную плазму крови человека или кролика.

В стерильных условиях взвешивают 10,0г или, соответственно, 1,0г продукта и помещают в колбы с 90,0см³ или, соответственно, 9,0см³ разбавленного фосфатного буфера, тщательно перемешивают.

Полученную смесь инкубируют при 37⁰С в течение 18-24 часов, затем 1,0см³ этой смеси переносят в пробирку с солевым бульоном (6,5% натрия хлорида) и снова инкубируют при 37⁰С в течение 24 часов.

Жидкие, пастообразующие и другие продукты, не подвергающиеся предварительной инкубации, в количестве 1,0г или 10,0г засевают в пробирки или колбы с солевым бульоном при соотношении продукта и среды 1:10. Посевы инкубируют при 37⁰С в течение 18-24 часов.

В обоих случаях для выделения чистой культуры стафилококков делают пересев петлей из солевого бульона на чашки Петри с подсушенными средами типа Байрд-Паркер или желточно-солевой агар (ЖСА) и снова инкубируют при 37⁰С в течение 18-24 часов.

Учет роста колоний:

– на среде Байрд-Паркер S.аureus растет в виде черных, блестящих, выпуклых колоний. При этом штаммы золотистого стафилококка, выделенные из пищевых продуктов и штаммы, продуцирующие энтеротоксин, на этой среде часто дают просветление через 24 часа инкубации при 37⁰С.

– на желточно-солевом агаре (ЖСА) колонии стафилококка имеют форму выпуклых дисков белого, желтого, кремового, лимонного цвета с ровным краем, окруженные зоной лецитиназной активности.

Из подозрительных на стафилококк колоний в любом случае готовят мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют.

При обнаружении грамположительных кокков, расположенных в виде скоплений, делают пересев на скошенный агар (МПА с 0,1% глюкозой) для накопления чистой культуры. Посевы инкубируют при 37⁰С в течение 24 часов.

Выделенную чистую культуру также обязательно исследуют на наличие фермента плазмокоагулазы. Для проведения реакции в стерильную пробирку с 0,5-1,0см³ цитратной плазмы крови кролика вносят одну петлю суточной агаровой культуры бактерий. Еще одну пробирку с плазмой крови оставляют незасеянной для контроля. Содержимое пробирок перемешивают и инкубируют при 37⁰С в течение 24 часов.

Результат реакции при этом учитывают через 2, 4, 6 и 24 часа. При учете реакции плазмокоагуляции возможно 2 варианта:

– реакция плазмокоагуляции считается положительной при образовании даже небольшого сгустка плазмы через 24 часа культивирования, соответственно, исследуемую культуру относят к коагулазоположительным, что в свою очередь свидетельствует о присутствии коагулазоположительных стафилококков в 10,0г или, соответственно, 1,0г (см³) продукта.

– реакция плазмокоагуляции считается отрицательной, если свертывание плазмы не происходит через 24 часа культивирования, исследуемую культуру относят к коагулазоотрицательным.

Отрицательная реакция плазмокоагуляции свидетельствует об отсутствии коагулазоположительного стафилококка в засеянной массе.

Определение Bacillus cereus.

Bacillus cereus – аэробные спорообразующие грамположительные палочки, некоторые штаммы которых способны продуцировать энтеротоксин.

Производят посев по 0,1см³ (0,01г) и по 0,2см³ (0,02г) сухих молочных продуктов из разведения 1:10 на поверхность хорошо подсушенной плотной специальной питательной среды Донована, разлитой в чашки Петри. Посевы инкубируют при 30⁰С в течение 24-96 часов. При отсутствии роста на обеих чашках дают заключение о соответствии детской сухой молочной смеси нормативу по этому показателю.

При обнаружении роста на среде Донована изучают выросшие колонии, учитывая при этом, что Bacillus cereus на среде Донована образуют крупные белые распластанные колонии с изрезанными краями, окруженные зоной глубокого белого матового коагулята или зоной просветления – результат проявления лецитиназной активности.

Из изучаемых колоний делают мазки, окрашивают по Граму и на наличие спор, затем микроскопируют, учитывая, что Bacillus cereus – грамположительные спорообразующие палочки. Для накопления чистых культур 3-5 колоний пересевают на скошенный агар с последующей инкубацией при 30⁰С в течение 24-48 часов. У выделенных чистых культур методом «висячей капли» определяют подвижность. Кроме этого, эти культуры засевают: на кровяной агар; на среду с маннитом; на среду Кларка для постановки реакции Фогес-Проскауэра (в пробирки).

Посевы инкубируют при 30⁰С в течение 24-48 часов. Характерными признаками для бактерий вида Bacillus cereus являются: наличие подвижности; положительная проба на лецитиназу;

– гемолитическая активность (образование зон просветления вокруг колоний) на кровяном агаре;

– отсутствие способности ферментировать маннит;

– положительная реакция Фогес-Проскауэра.

Подсчет обнаруженных в продукте бактерий вида B.сereus проводят путем умножения количества типичных выросших на среде Донована колоний на соответствующее разведение, и затем пересчитывают в расчете на 1,0г или 1,0см³ исследуемого продукта.

Экспресс-метод определения антибиотиков в пищевых продуктах

Допустимое значение антибиотиков для продуктов не должно превышать для тетрациклина 0,01ЕД, пенициллина – 0,01ЕД, стрептомицина – 0,5ЕД на 1,0г (мл) продукта.

Метод качественного и количественного обнаружения антибиотиков в пищевых продуктах и других субстратах, основан на подавлении антибиотиками дегидрогеназной активности тест-культур в жидкой питательной среде. Если антибиотик оказывает цитотоксическое действие, то клетки тест-культур теряют способность восстанавливать метиленовый синий в анаэробных условиях, поскольку метиленовый синий играет в этой системе одновременно роль акцептора водорода и индикатора.

Преимущество экспресс-метода заключается в возможности получения ответа через 4-5 часов, относительной простоте и значительной экономии питательной среды.

Методика проведения анализа состоит из нескольких этапов:

1. Подготовка проб к исследованию при качественном и количественном определении.

2. Получение и хранение взвеси из клеток тест-культур.

3. Определение «рабочей дозы» тест-культуры.

4. Определение концентрации антибиотиков в испытуемом растворе.

5. Качественное определение антибиотиков.