Этапы секвенирования путем химической деградации:

1. Мечение одного конца ДНК.

2. Проведение реакций модификации азотистых оснований и расщепление цепи ДНК по модифицированным основаниям.

Диметилсульфат используют для модификации аденина и гуанина, гидролиз по аденину проводится под действием кислой, а потом щелочной рН, гидролиз по гуанину происходит под действием пиперидина.

Гидразин используют для модификации цитозина и тимина в бессолевой среде, а в солевой среде (2М NaCl) только цитозина, расщепление модифицированных оснований происходит по действием пиперидина.

3. Секвенирующий электрофорез, радиоавтография, учет результатов.

4. Анализ информации, закодированной в секвенированном фрагменте.

Полиморфизм рестрикционных фрагментов (пдрф анализ)

Р

А В С

азличия ДНК близкородственных микроорганизмов с целью идентификации или типирования, а также мутации могут быть выявлены с помощью метода ПЦР – ПДРФ анализа.

1 2 3 4 5

1 2 3 4 5

Рис. 15. Результаты ПЦР-ПДРФ анализа 16 S рРНК генов для идентификации Bacteroides spp.: а ‑ продукты амплификации 16 S рРНК Bacteroides spp.(разные видыобразуют продукты одного размера – видна одна полоса); b и c ‑ hpa II и taq I рестрикционные профили Bacteroides spp.: треки 1, 2, 5 – B. thetaiotaomicron треки 3, 4 – B. fragilis

Под действием ферментов рестрикции амплифицированные участки ДНК нарезаются на различного размера фрагменты, которые при гель-электрофорезе образуют профили, идентифицируемые как определенный вид или тип микроорганизмов. Метод включает последовательное проведение: 1) экстракции ДНК, 2) ПЦР амплификации определенных генов, или их фрагментов, в результате чего генерируются мономорфные ДНК фрагменты, 3) рестрикции эндонуклеазами; 5) электрофореза рестрицированных образцов, 6) визуализации и анализа.

Эволюционный анализ (дендрограммы)

Благодаря появлению новых методов в поле зрения теории эволюции попали кодирующие молекулы: ДНК, РНК, белки. Анализ их эволюции положил начало молекулярной филогенетике. Молекулярный филогенетический анализ позволяет оценить историю эволюции без наличия полной информации о прошлом, лишь по состоянию современных видов и молекул. Он базируется на догме «молекулярных часов»: дивергенция геномов происходит вследствие накопления мутаций в ДНК/РНК, поэтому о длительности периода с момента расхождения геномов от одного предшественника свидетельствует количество измененных нуклеотидов. Чем раньше произошла дивергенция, тем большее количество изменений осуществилось в нуклеотидном составе. Молекулярная филогенетика определяет частоту и характер изменений в первичной структуре ДНК, белков и на основании этого производит реконструкцию эволюции генов и организмов, отображает направление происходящих изменений графически в виде дендрограмм. Существуют следующие разновидности дендрограмм: