Методы выявления капсул, жгутиков, спор
Для выявления некоторых бактерий и отдельных структур клеток применяют специальные методы окраски.
Окраска кислотоустойчивых бактерий по методу Циля-Нильсена:
1. На фиксированный мазок наносят карболовый раствор фуксина через полоску фильтровальной бумаги и подогревают до появления паров в течение 3-5 минут.
2. Снимают бумагу, промывают мазок водой.
3. На мазок наносят 5% раствор серной кислоты или 3% раствор солянокислого спирта на 1-2 минуты для обесцвечивания.
4. Промывают водой.
5. Докрашивают мазок водным раствором метиленового синего в течение 3-5 минут.
6. Промывают водой, высушивают и микроскопируют.
Выявление капсулы по методу Гинса:
1. На предметное стекло наносят каплю туши, а рядом – каплю исследуемого материала. Обе капли тщательно перемешивают и с помощью шлифованного стекла готовят мазок.
2. Мазок высушивают на воздухе и фиксируют на пламени горелки.
3. Мазок окрашивают фуксином в разведении 1:3 или сафранином. При этом бактерии окрашиваются в красный цвет, капсулы остаются неокрашенными и выделяются на темном фоне препарата.
Окраска жгутиков по Леффлеру:
1. Взвесь бактерий переносят в каплю воды, не перемешивают и высушивают.
2. Обрабатывают препарат 15-20 минут протравой (1 мл насыщенного спиртового раствора фуксина + смесь из 10 мл 25% водного раствора танина с 5 мл насыщенного водного раствора сернокислого железа).
3. Тщательно промывают водой и высушивают на воздухе.
4. Докрашивают фуксином Циля в течение 3-4 минут при легком подогревании.
5. Промывают водой, высушивают, микроскопируют.
Окраска спор по методу Ожешки:
1. На нефиксированный мазок наносят 0,5% раствор хлористоводородной кислоты и подогревают на пламени горелки в течение 2-3 минут.
2. Кислоту сливают, препарат промывают водой, просушивают и фиксируют над пламенем горелки.
3. Окрашивают препарат по Цилю-Нильсену. Споры бактерий при этом приобретают красный цвет, а вегетативные формы – синий.
Изучение микробов в живом состоянии
Клетки микроорганизмов в живом состоянии изучают методом раздавленной капли и методом висячей капли.
Метод раздавленной капли. На поверхность обезжиренного предметного стекла наносят каплю исследуемого материала или суспензию бактерий и покрывают ее покровным стеклом. Капля должна быть небольшой, не выходящей за края покровного стекла. Микроскопируют препарат с объективом х40. Метод раздавленной капли удобен для исследования подвижности бактериальных клеток, а также для изучения крупных микроорганизмов - плесневых грибов, дрожжей.
Метод висячей капли. Препарат готовят на покровном стекле, в центр которого наносят каплю бактериальной суспензии. Затем предметное стекло с лункой, края которого предварительно смазывают вазелином, прижимают к покровному стеклу так, чтобы капля находилась в центре лунки. Препарат переворачивают покровным стеклом вверх. В правильно приготовленном препарате капля должна свободно висеть над лункой, не касаясь ее дна или края. Для микроскопии используют вначале малый сухой объектив х8, под увеличением которого находят края капли, а затем устанавливают объектив х40 и исследуют препарат.
Контрольные вопросы по теме занятия:
1. Основные структурные элементы бактериальной клетки, их функции.
2. Особенности строения клеточной стенки. Строение клеточной стенки грамположительных и грамотрицательных бактерий.
3. Спорообразование у бактерий.
4. Включения в цитоплазму бактериальной клетки.
5. Простые методы окраски микробов.
6. Сложные методы окраски микробов (методы Грама, Циля-Нильсена, Бурри-Гинса, Ожешко). Методы обнаружения капсул, жгутиков, спор бактерий.
7. Сущность окраски микробов по Граму.
8. Техника приготовления мазков на предметных стеклах. Техника приготовления двух и более мазков на одном стекле.
9. Техника окраски микробов по Граму. Распределение микроорганизмов в зависимости от окраски по Граму.
10. Методы изучения микробов в живом состоянии.
Литература для подготовки к занятию:
Основная литература:
1. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. Под ред. А.А. Воробьева. М., 2004.
Дополнительная литература:
1. Л.Б. Борисов. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. М., 2002.
2. О.К. Поздеев. Медицинская микробиология. М., ГЭОТАР-МЕДИА, 2005.