Процессинг транскриптов синтезируемых рнк-полимеразой III

РНК-полимераза III (pol III) ответственна за синтез довольно разнообразного набора транскриптов – молекул 5S-рРНК, транспортных РНК, U6-мяРНК, 7SL-РНК сигнал распознающих частиц и нескольких малых цитоплазматических РНК (называемых Y-РНК в противоположность U-РНК, локализованным в ядре). В дополнение к большому разнообразию функций, выполняемых этими РНК, транскрипты, синтезируемые РНК-полимеразой III отличаются большим разнообразием механизмов процессинга, которым они подвергаются.

Процессинг 5S рРНК

5S рРНК связывается с 28S рРНК и 5,8S рРНК с образованием большой субчастицы рибосомы. Однако в отличие от других рибосомных РНК - 5S рРНК кодируется отдельным геном, транскрибируется другой РНК-полимеразой и подвергается иному варианту процессинга. Действительно, 5S рРНК отличается наиболее простой «судьбой» среди всех РНК-транскриптов эукариот. Она не подвергается кэпированию, а сохраняет 5^/-трифосфатную группировку, характерную для стадии инициации синтеза первичного транскрипта. Молекула 5S РНК не подвергается ни сплайсингу, ни полиаденилированию. Это единственная известная эукариотическая РНК, которая синтезируется зрелой, не требующей процессинга. Ее 5^/- и 3^/-концы защищены от деградации вторичными структурами, стабилизированными прочными взаимодействиями комплементарных пар оснований, и связанными с ними белками, как в случае с другими стабильными молекулами рРНК. У одних видов первичный транскрипт гена 5S рРНК представляет собой уже полностью зрелый продукт, делая его единственным известным примером эукариотической цитоплазматической РНК, которая не подвергается процессингу. У других видов 3^/-концы первичных транскриптов подравниваются экзонуклеазами до образования зрелой формы. Этот минимальный процессинг 5S рРНК у эукариот находится в сильном контрасте с ситуацией у прокариот, у которых 5S рРНК транскрибируется в составе единого крупного предшественника пре-рРНК и нуждается в процессинге 5^/- и 3^/-концов. К слову, матричные РНК прокариот используются непосредственно в виде первичных транскриптов.

Процессинг транспортных РНК

Предшественники транспортных РНК (пре-тРНК) включаются в реакции процессинга, часто значительно изменяющие структуру предшественников до того, как они приобретут зрелую форму: эти реакции включают расщепление по 5^/- и 3^/-концам, добавление нуклеотидов к 3^/-концам молекул, многочисленные специфические модификации внутренних нуклеотидов и, во многих случаях, удаление внутренних интронов.

5^/-концы транспортных РНК у организмов охватывающих все три царства живого образуются за счет эндонуклеолитического расщепления, катализируемого рибонуклеопротеидным комплексом – РНКазой Р (Rnase P). Эукариотическая РНКаза Р состоит из высококонсервативной РНК и девяти белков, которые узнают соответствующую шпилечную структуру в составе пре-тРНК. РНК-компонент РНКазы Р некоторых видов микроорганизмов может катализировать реакцию расщепления in vitro в отсутствие белковых кофакторов, но эта активность не была доказана для эукариотических ферментов (дополнительная информация по РНК-энзимам приведена в разделе, описывающем свойства интронов I и II групп). Интересно, что, как оказалось, процессинг большинства тРНК протекает в ядрышках, а не в нуклеоплазме, как думали в течение нескольких десятилетий.

Что касается 3^/-концов транспортных РНК все тРНК приобретают терминальную тринуклеотидную последовательность ССА, необходимую для реакции аминоацилирования, которая ответственна за присоединение аминокислоты к тРНК. У эукариот РНК-полимераза III терминирует транскрипцию за 3^/-концом зрелой тРНК. Затем избыточная 3^/-концевая последовательность удаляется под действием экзонуклеазы и терминальная ССА-последовательность добавляется с помощью РНК-нуклеотидил трансферазы (известной также как ССА-добавляющий фермент). Белок La, который связывается с участком поли-U на 3^/-концах молекул пре-тРНК и других транскриптов синтезируемых РНК-полимеразой III, необходим для правильного процессинга 3^/-концов.

В общем и целом, молекулы транспортных РНК составляют бóльшую часть класса высоко модифицированных РНК, каждая из которых включает около 100 различных видов модификаций нуклеозидов, расположенных в разных положениях внутренней нуклеотидной последовательности. Эти модификации – начиная с простого добавления метильных групп (как, например, в 1-метилгуанине) и заканчивая крупномасштабными перестройками структуры нуклеозидов (например, 2-метилтио-N⁶-треонилкарбамоиладенозин) – осуществляются посредством химического изменения структуры первоначально транскрибированных нуклеотидов без расщепления сахарофосфатного остова транспортных РНК. Энзимология этих модификаций часто чрезвычайно сложна, так что различные белки могут вносить одну и ту же модификацию нуклеозида, но по двум разным позициям в структуре тРНК. Полагают, что модифицированные нуклеозиды придают действию транспортных РНК неповторимость и специфичность.

Общим свойством пре-тРНК у эукариот (а также Archaea) является присутствие небольшого интрона на расстоянии в один нуклеотид от 3^/-конца антикодона (см. рис. ). Фактически сплайсинг тРНК был первым описанным способом удаления интронов. Этот способ удаления интронов по механизму его осуществления сильно отличается от механизма сплайсинга пре-мРНК – он не требует участия РНК-кофакторов (мяРНК), не имеют места реакции переэтерификации и не образуются промежуточные формы интронов в виде петель. Вместо этого интроны из пре-тРНК удаляются при участии ферментов. Первое – эндонуклеаза разрезает оба конца интрона формируя необычные 2^/-3^/-циклофосфатный и 5^/-ОН-концы. Эти концы не являются прямыми субстратами для лигазы, поэтому они соединяются вместе в ходе довольно сложной последовательности реакций: 5^/-ОН конец экзона фосфорилируется с образованием канонического 5^/-фосфатного конца; 2^/-3^/-циклофосфатный конец экзона превращается в 2^/-фосфатный конец, высвобождая свой 3^/-ОН конец; наконец эти сформированные, уже обычные 3^/-ОН и 5^/-фосфатный концы экзонов лигируются с участием РНК-лигазы. У дрожжей все эти три реакции (фосфорилирование, гидролиз 2^/-3^/-циклофосфатной связи и лигирование) катализируются одним и тем же ферментом. После этого отдельный фермент удаляет 2^/-фосфатную группу находящуюся на рибозильном остатке 3^/-конца экзона в точке сплайсинга. Весьма интересно, что мультифункциональная тРНК-лигаза принимает участие также в удалении по крайней мере одного интрона из пре-мРНК в сайте который утратил способность к сплайсингу в соответствии с правилом GU/AG или АТ/АС. Таким образом природа использует два полностью отличающихся механизма для удаления вставочных последовательностей из первичных транскриптов.

Процессинг малых РНК

В отличие от большинства основных UРНК, которые являются транскриптами РНК-полимеразы II, U6 мяРНК, MRP РНК (см. далее) и ряд других малых РНК транскрибируется с участием РНК-полимеразы III. U6 мяРНК является эволюционно наиболее консервативной мяРНК и одновременно наиболее важной для идентификации 5^/-сайта сплайсинга. 5^/-конец транскрипта U6 мяРНК сохраняет α-фосфатную группировку защищенную О-метилированием в отличие от 2,2,7-триметилгуанозинового кэпа, который формируется на 5^/-концах большинства молекул мяРНК транскрибируемых РНК-полимеразой II. Внутренние нуклеотиды U6 мяРНК подвергаются модификации сходной с модификацией рибосомных РНК, которая протекает в ядрышках (см. следующий раздел). На 3^/-конце находится фрагмент олиго-U определяющий терминацию транскрипции. Этот фрагмент сначала удлиняется не матрично в реакции зависящей от La аутоантигена, а затем укорачивается до 5 остатков U с формированием 2^/-3^/-циклофосфатного конца. Это позволяет связать комплекс из семи Lsm-белков (Lsm – like the Sm белков – белков похожих на Sm-белки входящие в состав других U мяРНП-комплексов) необходимых для образования ансамбля U4/U5/U6 три-мяРНП участвующего в сплайсинге. Хотя о процессинге других малых РНК, транскрибируемых РНК-полимеразой III, известно мало эти транскрипты также О-метилируются на 5^/-концах и подвергаются подравниванию на 3^/-концах.