И Н С Т Р У К Ц И Я

по выполнению практической работы № 65 по теме

«Химия крови. Определение уровня средних молекул в сыворотке крови».

Цели занятия:

1. Закрепить теоретические знания по темам «Химия крови» и «Химия белка».

2. Закрепить умения и навыки в работе с реактивами, оборудованием, посудой.

3. Провести биохимическое исследование – определение уровня средних молекул в сыворотке крови.

Исходный уровень знаний и умений.

Учащийся должен знать:

1. Понятие о крови как единой биохимической системе в организме человека.

2. Основные компоненты крови, их биологическую роль.

3. Патологию обмена белков: изменения уровня белка и/или остаточного азота в крови (гипо- и гиперпротеинемии, азотемии).

4. Патологические состояния, наблюдаемые в биохимической картине крови.

5. Роль лабораторной диагностики в исследовании крови как важнейшего источника сведений о состоянии здоровья человека.

Учащийся должен уметь:

1. Работать с химической посудой, пипетками, дозатором и др.

2. Работать с центрифугой, на спектрофотометре.

3. Приготовить необходимые реактивы и растворы для биохимического исследования.

4. Провести биохимическое исследование по предложенной методике.

5. Дать начальную интерпретацию полученному результату.

Структура занятия.

1. Теоретическая часть:

1. Повторение теоретического материала по темам «Химия крови» и «Химия белка».

2. Рассказ преподавателя.

К числу веществ белковой природы, не осаждаемых трихлоруксусной кислотой и по этой причине могущих быть отнесёнными к компонентам остаточного азота, причисляют в настоящее время так называемые молекулы средней массы, или средние молекулы. Интерес к исследованию этих молекул определяется тем, что они – важные универсальные факторы интоксикации. Химическая природа среднемолекулярных токсинов до сих пор точно не установлена. Известно, что они представляют собой олигопептиды с высоким содержанием дикарбоновых аминокислот, цистеина, лизина и глицина и низким содержанием ароматических аминокислот.

Оказывающие токсический эффект молекулы средней массы были выделены из диализной жидкости больных с хронической почечной недостаточностью.

Среднемолекулярные пептиды включают в себя гормоны, нейропептиды, медиаторы иммунного ответа и многие другие продукты белкового обмена, в целом определяющие высокую биологическую активность среднемолекулярных пептидов.

Если вначале к среднемолекулярным пептидам относили лишь простые и сложные пептиды, гликопептиды и нуклеопептиды, то в настоящее время – некоторые гуморальные регуляторы, в том числе инсулин, глюкагон, различные «тропины» и их комплексы, некоторые витамины, нуклеотиды и др.

Значительную часть средних молекул составляют продукты распада фибрина, витамины, поступающие в кровь из ЖКТ, а также метаболиты, образующиеся в процессе распада эндогенных белков. Состав среднемолекулярных пептидов различен в зависимости от вида патологии, характера осложнений. Концентрация средних молекул в плазме может зависеть от развития инфекции, уровня гипергидратации, особенностей лекарственной терапии и диеты. Для выделения из плазмы (сыворотки) крови средних молекул с успехом могут быть использованы способы ультрафильтрации на мембранах, гель-фильтрация на колонках, заполненных сефадексом G-15, а также методы, базирующиеся на различии в растворимости отдельных компонентов среднемолекулярных пептидов в спиртах и способности молекул средней массы не осаждаться трихлоруксусной кислотой.

В клинической практике доступными являются скрининговый метод (модификация А. Бабеля с соавторами, 1974) и модифицированный способ определения веществ группы средних молекул в биологических жидкостях.

2. Указания к занятию. Методические рекомендации:

   1. Внимательно изучите инструкцию.

   2. Приготовьте всё необходимое оборудование, реактивы для проведения анализа.

   3. Осмыслите ход выполнения лабораторной работы.

   4. Соблюдайте меры предосторожности в работе с реактивами, био-логическим материалом, на спектрофотометре.

   5. При работе с градуированной пипеткой используйте резиновую грушу с передником.

   6. Соблюдайте дезинфекционный режим в работе.

Практическая часть.

1. Лабораторная работа: «Определение уровня средних молекул в сыворотке крови».

1. Скрининговый метод определения уровня средних молекул (модификация А. Бабеля с соавторами, 1974).

ПРИНЦИП: Метод основан на освобождении сыворотки (или плазмы) крови от содержащихся в ней высокомолекулярных пептидов и белков с использованием ТХУ и количественном определении в полученной после центрифугирования надосадочной жидкости уровня среднемолекулярных пептидов по поглощению в монохроматическом световом потоке при длине волны 254 нм.

Реактивы: раствор ТХУ (100 г/л). Хранится в посуде из тёмного стекла при 4-10C. Готовится путём разбавления дистиллированной водой более концентрированного раствора (500 г/л).

Оборудование: спектрофотометр, позволяющий измерять оптическую плотность в ультрафиолетовой области спектра (250-260 нм) с использованием стандартных прямоугольных кварцевых кювет с длиной оптического пути 1 см; центрифуга; пробирки; пробирки центрифужные; штатив; пипетки.

Материал для исследования: сыворотка (плазма) крови или моча.