Тема 6. Фізіологія росту і живлення мікроорганізмів.

Фізіологія мікроорганізмів вивчає життєдіяльність мікробних клітин, процеси їх харчування, дихання, росту, розмноження, закономірності взаємодії з навколишнім середовищем.

Предметом вивчення медичної мікробіології є фізіологія патогенних і умовно-патогенних мікроорганізмів, здатних викликати захворювання людини. З'ясування фізіології цих мікроорганізмів важливо для постановки мікробіологічного діагнозу, розуміння патогенезу, проведення лікування й профілактики інфекційних захворювань, регуляції взаємин людину з навколишнім середовищем і т.д.

Хімічний склад бактерій

До складу мікроорганізмів входять вода, білки, нуклеїнові кислоти, вуглеводи, ліпіди, мінеральні речовини.

Вода – основний компонент бактеріальної клітини, що становить близько 80 % її маси. Вона перебуває у вільнім або зв'язаному стані зі структурними елементами клітини. У суперечках кількість води зменшується до 18.20 %. Вода є розчинником для багатьох речовин, а також виконує механічну роль у забезпеченні тургору. При плазмолізі – втраті клітиною води в гіпертонічному розчині – відбувається відшарування протоплазми від клітинної оболонки. Видалення води із клітини, висушування припиняють процеси метаболізму. Більшість мікроорганізмів добре переносять висушування. При недоліку води мікроорганізми не розмножуються. Висушування у вакуумі із замороженого стану (ліофілізація) припиняє розмноження й сприяє тривалому збереженню мікробних особин.

Білки (40.80 % сухої маси) визначають найважливіші біологічні властивості бактерій і складаються звичайно з комбінацій 20 амінокислот. До складу бактерій входить діамінопімелінова кислота (ДАП), відсутня в клітинах людини й тварин. Бактерії містять більш 2000 різних білків, що перебувають у структурних компонентах, що й беруть участь у процесах метаболізму. Більша частина білків має ферментативну активність. Білки бактеріальної клітини обумовлюють антигенність і імуногенність, вірулентність, видову приналежність бактерій.

Нуклеїнові кислоти бактерій виконують функції, аналогічні нуклеїновим кислотам еукаріотичних клітин: молекула ДНК у вигляді хромосоми відповідає за спадковість, рибонуклеїнові кислоти (інформаційна, або матрична, транспортна й рибосомна) беруть участь у біосинтезі білка.

Бактерії можна характеризувати (таксономічно) по змісту суми гуаніну й цитозина (ГЦ) у молярних відсотках (М%) від загальної кількості підстав ДНК. Більш точною характеристикою мікроорганізмів є гібридизація їх ДНК. Основа методу гібридизації ДНК – здатність денатурованої (однонитчатой) ДНК ренатурироваться, тобто з'єднуватися з комплементарною ниткою ДНК і утворювати двухцепочечную молекулу ДНК.

Вуглеводи бактерій представлені простими речовинами (моно- і дисахариди) і комплексними з'єднаннями. Полісахариди часто входять до складу капсул. Деякі внутрішньоклітинні полісахариди (крохмаль, глікоген і ін.) є запасними живильними речовинами.

Ліпіди в основному входять до складу цитоплазматичної мембрани і її похідних, а також клітинної стінки бактерій, наприклад зовнішньої мембрани, де, крім біомолекулярного шару ліпідів, є ЛПС. Ліпіди можуть виконувати в цитоплазмі роль запасних живильних речовин. Ліпіди бактерій представлені фосфоліпідами, жирними кислотами й гліцеридами. Найбільша кількість ліпідів (до 40 %) містять мікобактерії туберкульозу.

Мінеральні речовини бактерій виявляють у золі після спалювання клітин. У великій кількості виявляються фосфор, калій, натрій, сірка, залізо, кальцій, магній, а також мікроелементи (цинк, мідь, кобальт, барій, марганець і ін.).Вони беруть участь у регуляції осмотичного тиску, рН середовища, окисно-відновного потенціалу, активують ферменти, входять до складу ферментів, вітамінів і структурних компонентів мікробної клітини.

Харчування бактерій

Особливості харчування бактеріальної клітини складаються у вступі живильних субстратів усередину через усю її поверхню, а також у високій швидкості процесів метаболізму й адаптації до мінливих умов навколишнього середовища.

Типи харчування. Широкому поширенню бактерій сприяє різноманітність типів харчування. Мікроорганізми потребують вуглеводу, азоту, сірки, фосфору, калію й інших елементах. Залежно від джерел вуглецю для харчування бактерії діляться на аутотрофи (від грецьк. autos – сам, trophe – їжа), що використовують для побудови своїх клітин диоксид вуглецю З₂ і інші неорганічні з'єднання, і гетеротрофи ( від грецьк. heteros – інший, trophe – їжа), що харчуються за рахунок готових органічних сполук. Аутотрофними бактеріями є бактерії, що нітрифікують, перебувають у ґрунті; серобактерии, що живуть у воді із сірководнем; залізобактерії, що живуть у воді із закисним залізом, і ін.

Гетеротрофи органічні залишки, що утилізують, відмерли організмів у навколишньому середовищі, називаються сапрофітами. Гетеротрофи, що викликає захворювання в людини або тварин, відносять до патогенних і умовно-патогенних. Серед патогенних мікроорганізмів зустрічаються облигатні й факультативні паразити ( від грецьк. parasites – нахлібник). Облігатні паразити здатні існувати тільки усередині клітини, наприклад риккетсії, віруси й деякі найпростіші.

Залежно від окиснюваного субстрату, називаного донором електронів або водню, мікроорганізми ділять на дві групи. Мікроорганізми, що використовують у якості донорів водню неорганічні з'єднання, називають літотрофними ( від грецьк. lithos – камінь), а мікроорганізми, що використовують у якості донорів водню органічні сполуки, – органотрофами.

Враховуючи джерело енергії, серед бактерій розрізняють фототрофи, тобто фотосинтезуючі (наприклад, синьо-зелені водорості, що використовують енергію світла), і хемотрофи енергії, що бідують у хімічних джерелах.

Фактори росту. Мікроорганізмам для росту на живильних необхідні середовищах певні додаткові компоненти, які одержали назву факторів росту. Фактори росту – необхідні для мікроорганізмів з'єднання, які вони самі синтезувати не можуть, тому їх необхідно добавлят у живильні. середовища Серед факторів росту розрізняють: амінокислоти, необхідні для побудови білків; пурини й піримідини, які потрібні для утворення нуклеїнових кислот; вітаміни, що входять до складу деяких ферментів. Для позначення відносини мікроорганізмів до факторів росту використовують терміни «ауксотрофи» і «прототрофи». Ауксотрофи потребують одного або декількох факторах росту, прототрофи можуть самі синтезувати необхідні для росту з'єднання. Вони здатні синтезувати компоненти із глюкози й солей амонію.

Механізми харчування. Вступ різних речовин у бактеріальну клітину залежить від величини й розчинності їх молекул у ліпідах або воді, рН середовища, концентрації речовин, різних факторів проникності мембран і ін. Клітинна стінка пропускає невеликі молекули й іони, затримуючи макромолекули масою більш 600 Д. Основним регулятором вступу речовин у клітину є цитоплазматична мембрана. Умовно можна виділити чотири механізми проникнення живильних речовин у бактеріальну клітину: це проста дифузія, полегшена дифузія, активний транспорт, транслокація груп. Найбільш простий механізм вступу речовин у клітину – проста дифузія, при якій переміщення речовин відбувається внаслідок різниці їх концентрації по обидві сторони цитоплазматичної мембрани. Речовини проходять через ліпідну частину цитоплазматичної мембрани (органічні молекули, лікарські препарати) і рідше по заповненим водою каналам у цитоплазматичній мембрані. Пасивна дифузія здійснюється без витрати енергії.

Полегшена дифузія відбувається також у результаті різниці концентрації речовин по обидві сторони цитоплазматичної мембрани. Однак цей процес здійснюється за допомогою молекулнпереносників, що локалізуються в цитоплазматичній мембрані, що й володіють специфічністю. Кожний переносник транспортує через мембрану відповідна речовина або передає іншому компоненту цитоплазматичної мембрани – властиво переноснику.

Білками-переносниками можуть бути пермеази, місце синтезу яких – цитоплазматична мембрана. Полегшена дифузія протікає без витрати енергії, речовини переміщаються від більш високої концентрації до більш низкою.

Активний транспорт відбувається за допомогою пермеаз і спрямований на перенос речовин від меншої концентрації убік більшої, тобто як би проти плину, тому даний процес супроводжується витратою метаболічної енергії (АТФ), що утворюється в результаті окисно-відновних реакцій у клітині.

Перенос (транслокація) груп подібний з активним транспортом, відрізняючись тим, що стерпна молекула видозмінюється в процесі переносу, наприклад фосфорилюється. Вихід речовин із клітини здійснюється за рахунок дифузії й при участі транспортних системеферменти бактерій. Ферменти розпізнають відповідні їм метаболіти (субстрати), вступають із ними у взаємодію й прискорюють хімічні реакції. Ферменти є білками, беруть участь у процесах анаболізму (синтезу) і катаболізму (розпаду), тобто метаболізму. Багато ферментів взаємозалежні зі структурами мікробної клітини. Наприклад, у цитоплазматичній мембрані є окисно-відновні ферменти, що участвующие в дихання й розподілі клітини; ферменти, що забезпечують харчування клітини, і ін. Окисно-відновні ферменти цитоплазматичної мембрани і її похідних забезпечують енергією інтенсивні процеси біосинтезу різних структур, у тому числі клітинної стінки. Ферменти, пов'язані з розподілом і аутолізом клітини, виявляються в клітинній стінці. Так звані ендоферменти каталізують метаболізм, що проходить усередині клітини.

Екзоферменти виділяються клітиною в навколишнє середовище, розщеплюючи макромолекули живильних субстратів до простих сполук, засвоюваних клітиною в якості джерел енергії, вуглецю й ін. Деякі екзоферменти (пеніцилліназа й ін.) інактивують антибіотики, виконуючи захисну функцію.

Розрізняють конститутивні й індуцибельні ферменти. До конститутивних ферментів відносять ферменти, які синтезуються клітиною безупинно, незалежно від наявності субстратів у живильній. середовищі Індуцибельні (адаптивні) ферменти синтезуються бактеріальною клітиною тільки при наявності в середовищі субстрату даного ферменту. Наприклад, β-галактозидаза кишковою паличкою на середовищі із глюкозою практично не утворюється, але її синтез різко збільшується при вирощуванні на середовищі з лактозою або іншим β-галактозидозом.

Деякі ферменти (так звані ферменти агресії) руйнують тканину й клітини, обумовлюючи широке поширення в інфікованій тканині мікроорганізмів і їх токсинів. До таких ферментів відносять гіалуронідазу, колагеназу, дезоксирибонуклеазу, нейрамінідазу, лецитиназу й ін. Так, гіалуронідаза стрептококів, розщеплюючи гіалуронову кислоту сполучної тканини, сприяє поширенню стрептококів і їх токсинів.

Відомо більш 2000 ферментів. Вони об'єднані в шість класів: оксидоредуктази – окисно-відновні ферменти (до них відносять дегідрогенази, оксидази й ін.); трансферази окремі радикали, що переносять, і атоми від одних сполук до інших; гідролази, що прискорюють реакції гідролізу, тобто розщеплення речовин на більш прості із приєднанням молекул води (естерази, фосфатази, глікозидази й ін.); ліази, які відщеплюють від субстратів хімічні групи негідролітичним шляхом (карбоксилази й ін.); ізомерази органічні сполуки, що перетворюють, у їхні ізомери (фосфогексоізомераза й ін.); лігази, або синтетази, що прискорюють синтез складних сполук із більш простих (аспарагінсинтетаза, глютамінсинтетаза й ін.).

Відмінності у ферментному складі використовуються для ідентифікації мікроорганізмів, тому що вони визначають їхні різні біохімічні властивості: сахаролітичні (розщеплення цукрів), протеолітичні (розкладання білків) і інші розщеплення, що виявляються по кінцевих продуктах (утвір лугів, кислот, сірководню, аміаку й ін.).

Ферменти мікроорганізмів використовують у генетичній інженерії (рестриктази, лігази й ін.) для одержання біологічно активних сполук, оцтової, молочної, лимонної й інших кислот, молочнокислих продуктів, у виноробстві й інших галузях. Ферменти застосовують як біодобавки в пральні порошки («Ока» і ін.) для знищення забруднень білкової природи.

Дихання бактерій

Дихання, або біологічне окиснення, засноване на окисно-відновних реакціях, що йдуть із утворенням АТФ - універсального акумулятора хімічної енергії. Енергія необхідна мікробній клітині для її життєдіяльності. При дихання відбуваються процеси окиснення й відновлення: окиснення – віддача донорами (молекулами або атомами) водню або електронів; відновлення – приєднання водню або електронів до акцептора. Акцептором водню або електронів може бути молекулярний кисень (такий Дихання називається аеробним) або нітрат, сульфат, фумарат (такий Дихання називається анаеробним – нітратним, сульфатним, фумаратним). Анаеробіоз ( від грецьк. аег – повітря + bios – життя) – життєдіяльність, що протікає при відсутності вільного кисню. Якщо донорами й акцепторами водню є органічні сполуки, то такий процес називається бродінням. При бродінні відбувається ферментативне розщеплення органічних сполук, переважно вуглеводів, в анаеробних умовах. З урахуванням кінцевого продукту розщеплення вуглеводів розрізняють спиртове, молочнокисле, оцтовокисле й інші види бродіння.

Стосовно молекулярного кисню бактерії можна розділити на три основні групи: облігатні, тобто обов'язкові, аероби, облігатні анаероби й факультативні анаероби.

Облігатні аероби можуть рости тільки при наявності кисню. Облігатні анаероби (клостридії ботулізму, газової гангрени, правця, бактероїди й ін.) ростуть тільки на середовищі без кисню, який для них токсичний. При наявності кисню бактерії утворюють перекісні радикали кисню, у тому числі перекис водню й супероксидоаніон кисню, токсичні для облигатных анаеробних бактерій, оскільки вони не утворюють відповідні инактивирующие ферменти. Аеробні бактерії інактивують перекис водню й супероксидоаніон відповідними ферментами (каталазою, пероксидазою і супероксиддисмутазою). Факультативні анаероби можуть рости як при наявності, так і при відсутності кисню, оскільки вони здатні перемикатися з дихання в присутності молекулярного кисню на бродіння в його відсутність. Факультативні анаероби здатні здійснювати анаэробное Дихання, називаний нітратним: нітрат, що є акцептором водню, відновлюється до молекулярного азоту й аміаку.Серед облигатних анаеробів розрізняють аеротолерантні бактерії, які зберігаються при наявності молекулярного кисню, але не використовують його.

Для вирощування анаеробів у бактеріологічних лабораторіях застосовують анаеростати – спеціальні ємності, у яких повітря заміняється сумішшю газів, що не містять кисню. Повітря можна видаляти з живильних шляхом середовищ кип'ятіння, за допомогою хімічних адсорбентів кисню, що містяться в анаеростати або інші ємності з посівами.

Ріст і розмноження бактерій

Життєдіяльність бактерій характеризується ростом – формуванням структурно-функціональних компонентів клітини й збільшенням самої бактеріальної клітини, а також розмноженням – самовідтворенням, що приводять до збільшення кількості бактеріальних клітин у популяції.

Бактерії розмножуються шляхом бінарного поділу навпіл, Рідше шляхом брунькування.

Актиноміцети, як і гриби, можуть розмножуватися спорами. Актиноміцети, будучи розгалуженими бактернями, розмножуються шляхом фрагментації ниткоподібних клітин. Грампозитивні бактерії діляться шляхом уростання перегородок, що синтезуються, поділу усередину клітини, а грамнегативні – шляхом перетяжки, у результаті утвору гантелеподібних фігур, з яких утворюються дві однакові клітини.

Поділу клітин передує реплікація бактеріальної хромосоми по напівконсервативному типу (двоспіральний ланцюг ДНК розкривається й кожна нитка добудовується комплементарною ниткою), що приводить до подвоєння молекул ДНК бактеріального ядра – нуклеоїда. Реплікація хромосомної ДНК здійснюється від початкової точки огі (від англ, origin – початок).

Хромосома бактеріальної клітини зв'язана в області огі із цитоплазматичною мембраною. Реплікація ДНК каталізується ДНК-полімеразами. Спочатку відбувається розкручування (деспіралізація) подвійному ланцюга ДНК, у результаті чого утворюється реплікативна вилка (розгалужені ланцюги); одна з ланцюгів, добудовуючись, зв'язує нуклеотиди від 5'- до 3'-кінця, інша – добудовується посегментно.

Реплікація ДНК відбувається в три етапи: ініціація, елонгація, або ріст ланцюги, і терминація. Що утворювалися в результаті реплікації дві хромосоми розходяться, чому сприяє збільшення розмірів зростаючої клітини: прикріплені до цитоплазматичної мембрани або її похідних (наприклад, мезосомам) хромосоми в міру збільшення обсягу клітини віддаляються друг від друга. Остаточне їхнє відокремлення завершується утворенням перетяжки або перегородки поділу. Клітини з перегородкою поділу розходяться в результаті дії аутолітичних ферментів, що руйнують серцевину перегородки поділу. Аутоліз при цьому може проходити нерівномірно:, що діляться клітини в одній ділянці залишаються зв'язаними частиною клітинної стінки в області перегородки поділу. Такі клітини розташовуються під кутом друг до друга, що характерно для дифтерійних корінебактерій.

Розмноження бактерій у рідкій живильній. середовищі Бактерії, засіяні в певн, що не змінюється обсяг живильного середовища, розмножуючись, споживають живильні елементи, що приводить надалі до виснаження живильного середовища й припиненню росту бактерій. Культивування бактерій у такій системі називають періодичним культивуванням, а культуру – періодичної. Якщо ж умови культивування підтримуються шляхом безперервної подачі свіжого живильного середовища й відтоку такого ж обсягу культуральної рідини, то таке культивування називається безперервним, а культура – безперервної.

При вирощуванні бактерій на рідкій живильній спостерігається середовищі придонний, дифузійний або поверхневий ( у вигляді плівки) ріст культури. Ріст періодичної культури бактерій, вирощуваних на рідкій живильній, середовищі підрозділяють на кілька фаз, або періодів:

• лаг-фаза;

• фаза логарифмічного росту;

• фаза стаціонарного росту, або максимальної концентрації

• бактерій;

• фаза загибелі бактерій.

Ці фази можна зобразити графічно у вигляді відрізків кривій розмноження бактерій, що відбиває залежність логарифма числа живих клітин від часу їх культивування. Лаг-фаза ( від англ, lag – запізнювання) – період між посівом бактерій і початком розмноження. Тривалість лаг-фази в середньому 4.5 ч. Бактерії при цьому збільшуються в розмірах і готуються до поділу; наростає кількість нуклеїнових кислот, білка й інших компонентів. Фаза логарифмічного (експонентного) росту є періодом інтенсивного поділу бактерій.

Тривалість її близько 5.6 год. При оптимальних умовах росту бактерії можуть ділитися кожні 20-40 хв. Під час цієї фази бактерії найбільш ранимі, що пояснюється високою чутливістю компонентів метаболізму інтенсивно зростаючої клітини до інгібіторів синтезу білка, нуклеїнових кислот і ін. Потім наступає фаза стаціонарного росту, при якій кількість життєздатних клітин залишається без змін, становлячи максимальний рівень ( М-Концентрація). Її тривалість виражається в годиннику й коливається залежно від виду бактерій, їх особливостей і культивування. Завершує процес росту бактерій фаза загибелі, що характеризується відмиранням бактерій в умовах виснаження джерел живильного середовища й нагромадження в ній продуктів метаболізму бактерій. Тривалість її коливається від 10 год до декількох тижнів. Інтенсивність росту й розмноження бактерій залежить від багатьох факторів, у тому числі оптимального складу живильного середовища, окисно-відновного потенціалу, рН, температури й ін.

Розмноження бактерій на щільній живильній. середовищі Бактерії, що ростуть на щільних живильних, середовищах утворюють ізольовані колонії округлої форми з рівними або нерівними краями (S- і R-форми), різної консистенції й коліру, що залежить від пігменту бактерій.

Пігменти, розчинні у воді, дифундують у живильну й середовище офарблюють її, наприклад синегнійна паличка (Pseudomonas aeruginosa) офарблює середовище в синій колір. Інша група пігментів нерозчинна у воді, але розчинна в органічних розчинниках. Так, колонії « чудесної палички» мають криваво-червоний пігмент, розчинний у спирті. І, нарешті, існують пігменти, не розчинні ні у воді, ні в органічних сполуках.

Найпоширеніші серед мікроорганізмів такі пігменти, як каротини, ксантофіли й меланіни. Меланіни є нерозчинними пігментами чорного, коричневого або червоного кольори, що синтезуються з фенольних сполук. Меланини поряд з каталазою, супероксидцисмутазой і перокдсидазами захищають мікроорганізми від впливу токсичних перекісних радикалів кисню. Багато пігментів мають антимікробний, антибіотикоподібною дією.

Вид, форма, колір і інші особливості колоній на щільній живильній можуть середовищі враховуватися при ідентифікації бактерій, а також доборі колоній для одержання чистих культур.

У промислових умовах при одержанні біомаси мікроорганізмів з метою готування антибіотиків, вакцин, діагностичних препаратів, еубіотиків культивування бактерій і грибів здійснюють у ферментерах при строгім дотриманні оптимальних параметрів для росту й розмноження культур.