акушерство, гинекология и биотехника размножения

Петри, на дно которых кладут увлажненную фильтровальную бумагу. Таким образом сохраняется жизнеспо-

собность зародышей и обеспечивается

возможность более точного выявления их полноценности.

Среда для замораживания зародышей

состоит из следующих компонентов, г/л:

натрия хлорид 8,0; калия хлорид 0,2; гид-

роортофосфат (динатрийфосфат) без-

водный 1,15; дигидроортофосфат (монокалийфосфат) однозамещенный 0,2;

магния хлорид, содержащий 6 молекул

воды, 0,1; калия хлорид безводный 0,1,

натрия пируват 0,076; глюкоза 1,0. В этот

раствор добавляют 20 % фетальной сыворотки крови теленка и 100 тыс. ЕД/л

пенициллина (калиевой соли). Среду

готовят в стерильных условиях в день

применения. Часть среды используют

для приготовления рабочего раствора (к 8 мл среды добавляют 1000 ЕД пени-

циллина и 2 мл фетальной сыворотки).

Затем готовят серию растворов с разной

концентрацией глицерина по методике,

изложенной в инструкции, и насыщают зародыш глицерином одноили много-

ступенчатым способом. Этот процесс

контролируют под микроскопом в сте-

рильных условиях при температуре 20 °С, после чего зародыши сразу замораживают в стеклянных пробирках или

ампулах, пластиковых соломинках, ко-

торые маркируют.

Охлаждение проводят в несколько этапов: 1) снижают температуру от 20 до –5...7 °С со скоростью 1...10 °С в

1 мин; 2) при –6...7 °С проводят искус-

ственную кристаллизацию, касаясь пинцетом, переохлажденным в жидком азоте, поверхности контейнера с зародышами; 3) продолжают охлаждать со скоростью 0,3 °С в 1 мин до –36 °С;

4) погружают в жидкий азот для быст-

рого охлаждения до –196 °С. Хранят замороженные эмбрионы в сосудах Дью-

ара. Для оттаивания емкости с зароды-

шами быстро переносят в водяную

баню с температурой 25...37 °С и держат до исчезновения льда.

Вместе с раствором криопротектора

эмбрион помещают на часовое стекло,

предварительно оценивают под лупой и удаляют криопротектор, помещая зародыш в заранее приготовленные ра-

створы глицерина убывающей концен-

трации. Затем еще раз оценивают каче-

ство зародышей под микроскопом.

Когда эмбрионов замораживают в соломинках с раствором глицерина и саха-

розы, то после оттаивания соломинку

несколько раз встряхивают (подобно

термометру). При этом пробка, закры-

вающая соломинку, должна быть направлена вверх. Для уравновешивания

осмотического давления и удаления

криопротектора из зародыша соломин-

ку помещают вертикально (пыжом

вверх) в водяную баню с температурой 25...37 °С. Затем приступают к пересад-

ке эмбриона (Н. И. Сергеев, С. А. Ма-

зепкин).

Разработаны и другие способы куль-

тивирования зародышей вне организма, позволяющие сохранять их жизне-

способность до 24...48 ч. Зародышей

можно культивировать в пробирках, а

также в ампулах и пайеттах из поливинилхлорида. До 4...7 сут сохранить их можно в перевязанном яйцепроводе

кролика. Однако наиболее перспектив-

ным методом является глубокое замораживание зародышей в жидком азоте при –196 °С. Зародыши крупного рогатого скота лучше других переносят за-

мораживание и размораживание; вы-

живаемость — 50...70 %.

Научные наблюдения и практиче- ский опыт показывают, что при пересадке зародышей отличного и хорошего качества беременность развивается

примерно у 40—60 % реципиентов, по-

средственных — у 30 и плохих — у 20 % животных. Самым точным доказатель-

ством полноценности зародыша явля-

ется рождение здорового теленка.

Реципиент — животное, которому трансплантируют (пересаживают) в

матку одного или двух зародышей на

ранней стадии их развития. После пересадки в организме реципиента должны быть обеспечены оптимальные условия

для дальнейшего развития зародыша и

рождения жизнеспособного плода. От-

бирают 6...8 реципиентов на каждого

донора из числа животных, не имеющих большой племенной ценности. При

этом используют телок в возрасте

16...18 мес с массой 350...380 кг или ко-

ров не старше 7 лет. Животные должны

быть здоровыми, без признаков нарушения обмена веществ. Успех переса-

док в значительной степени зависит от

физиологически полноценного течения

половых циклов и правильного опреде-

ления охоты у реципиентов. Необходимо тщательно контролировать течение

последних двух половых циклов и все

дальнейшие показатели регистрировать

в соответствующей документации (ка-

лендарь полового цикла). Половые цик-

лы должны протекать регулярно, быть полноценными, с синхронным формированием стадии возбуждения. Живот-

ных с нерегулярными, неполноценны-

ми половыми циклами, с ненормальной

продолжительностью отдельных фено-

менов стадии возбуждения полового цикла исключают из числа реципиен-

тов. Реципиенты должны быть в состоя-

нии средней упитанности, с хорошим

физическим развитием, иметь крупный,

правильной формы таз. Яичники и матка должны быть нормально развиты, без

патологических изменений.

Отобранных реципиентов еще раз

обязательно обследуют перед транс-

плантацией зародышей. Яичники должны быть типичными для соответству-

ющей стадии полового цикла, без кист.

Уточняют степень развития и положе-

ние желтого тела.

При пересадке зародышей состоя-

ние всего организма и половой системы реципиента, в том числе состояние яичников, фаза дифференцировки эндометрия, должны соответствовать ста-

дии развития зародышей. Только в

этом случае последние попадают в условия, благоприятные для их приживления и развития. Если разница в сроках проявления полового цикла между

донором и реципиентом составляет бо-

лее 24 ч, то частота беременностей после пересадок резко снижается. Пересадку зародышей в производственных

условиях лучше проводить при точной

синхронности полового цикла у доно-

ров и реципиентов. В случае неточного

совпадения предпочтение отдается реципиентам, у которых охота прояви-

лась несколько раньше, чем у доноров. Результаты 2556 пересадок зароды-

шей (Schneider и др., 1980) показали,

что при точной синхронизации доноров и реципиентов беременность после пересадки развивалась у 67 % животных. Если охота у реципиента была на

12 ч раньше или позже, чем у донора,

беременность устанавливали у 60...61 % реципиентов.

Пересадку зародышей реципиентам удавалось осуществить только до 16-го

дня после выявления охоты. В более поздние сроки беременность не развивает-

ся, так как начинается обратное развитие желтого тела и в проводящих поло-

вых путях протекают процессы разруше-

ния и обновления слизистых оболочек и

подготовки их к очередной стадии воз-

буждения полового цикла. Аналогич- ные изменения проявляются во всем организме самки. Поэтому при боль-

шом поголовье животных (200...400 ре-

ципиентов) для осуществления пересадок подбирают коров и телок, у которых стадия возбуждения полового цик-

ла естественно наступила в те же

сроки, что и у доноров.

При небольшом количестве живот-

ных-реципиентов возникает необходимость в синхронизации полового цикла

у реципиентов и доноров путем ис-

пользования простагландинов и геста-

генов. Через 2...3-е суток после приме-

нения этих препаратов коровы и телки приходят в охоту. Необходимо учиты-

вать, что проявление начала стадии возбуждения полового цикла у отдельных животных различное, поэтому в

каждом случае для своевременного и

полного выявления охоты нужно использовать самцов-пробников. Несвоевременное выявление животных в

охоте снижает процент развития бере-

менности после пересадки зародышей.

При использовании замороженных

зародышей нет необходимости в синхронизации полового цикла реципиен-

тов и доноров. В этом случае зароды-

шей можно пересаживать в сроки, ког-

да у реципиентов естественно насту-

пят соответствующие дни полового цикла.

Пересадку зародышей осуществля-

ют хирургическим и нехирургическим

способами. Непосредственно перед пересадкой еще раз обследуют состояние

здоровья и половой системы реципиен-

тов, выявляют, в каком яичнике нахо-

дится желтое тело, соответствуют ли

его размер и консистенция срокам полового цикла. Наилучшим местом пересадки считают верхушку рога матки,

прилегающего к яичнику с желтым телом.

Хирургический способ пересадки зародышей. Чаще применяют на телках.

Можно использовать оперативный до-

ступ с разрезом по белой линии живота. Подготовка и техника операции такие же, как при извлечении зародышей. Рог матки подтягивают к разрезу,

его стенки перфорируют тупой иглой в

участке с наименьшим количеством сосудов, примерно в 4 см от верхушки рога. Затем через маленькую ранку с

помощью пастеровской пипетки в не-

большом количестве среды для культи-

вирования вводят зародыш в направле-

нии верхушки рога. После этого заши-

вают брюшную стенку по всем прави-

лам хирургической операции.

Более удобным, практичным и быстрым является хирургический способ

пересадки зародыша с разрезом брюш-

ной стенки в области голодной ямки.

Оперируют животных в стоячем положении с использованием успокаиваю-

щих средств и местного обезболивания.

Разрез должен быть расположен как

можно дальше в каудальном направлении. Верхушку рога матки подводят к разрезу, удерживая пальцами за широкую маточную связку. Зародыш переса-

живают по направлению к верхушке

рога матки, как при операции по белой линии живота; приживляется до 85 % зародышей.

Нехирургический способ пересадки зародышей. Более пригоден для ис-

пользования его в производственных

условиях. Для этого применяют раз-

личные катетеры (рис. 3.6). Часто ис-

пользуют прибор для искусственного

осеменения Касу в модифицированной форме с длиной трубки 50 см и наруж-

ным диаметром 2,5 мм. Зародыш под-

могут развиться аутоиммунные реакции, ведущие к нарушению репродуктивной функции, вплоть до бесплодия.

Объем спермы и концентрация в

ней спермиев у различных видов не одинаковы. Непарнокопытные, всеядные, плотоядные, грызуны выделяют

сперму (продукт жизнедеятельности

всего полового аппарата самца) в отно-

сительно большом объеме, но с низкой

концентрацией спермиев (обычно 0,1...

0,2 млрд в 1 мл). У жвачных животных

сперма выделяется в небольшом объе-

ме, но с большой концентрацией спер-

миев (более 1 млрд в 1 мл) (В. К. Мило-

ванов, 1962). Объем одного эякулята (объем спермы при одном акте спермо-

выделения) составляет в среднем: у же-

ребца 50...100 мл, у хряка 250, у собаки

10, у быка 4...5, у барана 1...2, у кролика

0,5 мл. Общее число спермиев в эякуляте у жеребца составляет 4...20 млрд, у

хряка — 20...80, у кролика 0,1...0,2 млрд.

Максимальные показатели объема

эякулята (до 1200 мл) и числа спермиев

в нем (до 120 млрд) отмечены у хряков. Исходя из того, что при оплодотво-

рении с яйцеклеткой сливается один

(или два) спермия, во всяком случае,

«для оплодотворения требуется незна- чительное количество семени» (Спалланцани, 1780); в начале XX в. господ-

ствовала теория о «расточительности»

природы, производящей гаметы якобы в ненужном избытке. Однако благодаря методу искусственного осеменения (оплодотворения), основоположник ко-

торого — русский биолог И. И. Иванов,

оказалось, что для каждого вида животных имеется минимальный объем спермы и минимальное число спермиев в ней, необходимых для эффективного оплодотворения. Оптимально раз-

бавлять сперму (без потери ее оплодо-

творяющей способности) для большинства видов животных следует в

2...4 раза. Таким образом, для эффек-

тивного оплодотворения в половые

пути самки необходимо одновременное поступление сотен миллионов спермиев. Как же объяснить необходимость

такого огромного количества спермиев

для оплодотворения одной яйцеклетки (или нескольких — у многоплодных животных)?

Согласно представлению о нерав-

нозначности спермиев по фертильным

свойствам и антигенной характеристи-

ке (В. И. Говалло, 1983, 1987) одни из спермиев обладают фертильностью, а

другие не обладают. Спермии содержат

только им присущие антигены (аутоан-

тигены) и антигены, общие с другими

клетками, в частности с мозгом, антигенами групп крови, тканевой совмес-

тимости (аллоантигены), а также анти-

гены, одинаковые у представителей

разных видов (ксеноантигены).

Фертильные спермии при созревании в придатке семенника приобрета-

ют оболочечный антиген, сходный с

антигенами цервикальной слизи, внут-

риматочной среды и клеток женского

полового тракта. Этот антиген наглухо покрывает (как бы одевает) весь спер-

мий, тем самым «маскируя» от иммун-

ной системы самки находящиеся под

оболочкой спермия специфические антигены и способствуя беспрепятственному продвижению фертильных

спермиев в ее половых путях. Данный

антиген вырабатывается в семенниках и абсорбируется на эпидидимальных спермиях, его называют обволакивающим и относят к антигенам класса SCA

(Spermatozoa Coating Antigen).

У самок генитальный тракт, особенно матка, обильно насыщен иммунокомпетентными клетками, способными распознавать чужеродный генети- ческий материал (Т-лимфоциты), фаго-

цитировать его (макрофаги) и локально

продуцировать антитела (В-лимфоци- ты). Скопление лимфоидных тканей

репродуктивного тракта самок живот-

ных подобно пейеровым бляшкам ки-

шечника или лимфоидным скоплениям в бронхах. Локальный иммунитет (продукция антител) может возникать

при непосредственном контакте слизи-

стой оболочки матки с антигеном и быть относительно независимым от общего гуморального ответа, что свиде-

тельствует о наличии локальной защит-

ной системы (первичного барьера),

препятствующего проникновению ан-

тигенов из внешней среды в организм. Так, ксеногенные спермии, искусст-

венно введенные в половые пути сам-

ки, полностью погибают в репродук-

тивном тракте, не достигая яйцепро-

âîäà.

При участии Т-лимфоцитов, анти-

тел, макрофагов значительная часть

спермиев погибает в половых путях

самки. Макрофаги с фагоцитирован-

ными спермиями поступают в лимфатические узлы, дренирующие матку,

вызывая при этом значительное их уве-

личение, с последующей сенсибилиза-

цией матки и всего организма, иммун-

ная система которого реагирует на спермальные антигены изменением

соотношения Т-лимфоцитов в пользу

Т-супрессоров. Это указывает на нали-

чие иммуновспомогательной функции спермиев.

Массовый фагоцитоз спермиев,

развивающийся уже через несколько

часов после контакта слизистой оболочки со спермой, возможно, играет роль пускового механизма для миграции лимфоидных элементов из кост-

ного мозга в слизистую оболочку мат-

ки и для дифференцировки предшественников лимфоцитов-супрессоров. Полноценный фагоцитоз спермиев отсутствует, если в цервикальной слизи и маточной жидкости присутствуют

антитела и (IgG и SIgA) к спермиям,

которые препятствуют также последующей капацитации (сбрасывание обо-

лочечных антигенов) спермиев. Ак-

тивный местный синтез антител к

спермиям отмечен у большинства бесплодных животных (М. А. Петров, 2007).

Погибающие спермии выделяют

продукты, способствующие продвижению по половым путям к цели фертильных спермиев (изменение рН, воз-

можное отвлечение от фертильных

спермиев макрофагов, антител и др.)

Фертильные спермии, еще не достиг-

нув яйцеклетки, сбрасывают неспецифический оболочечный антиген класса

SCA и начинают выделять фермент ги-

алуронидазу, способную разрушать ги-

алуроновую кислоту прозрачной обо-

лочки яйцеклетки, которая становится проницаемой для пептидгидролаз и

других ферментов, находящихся под

прозрачной оболочкой, а также для

спермиев. Ферменты, вышедшие из

яйцеклетки, разрушают акросомальные пузырьки, прикрывающие головку

спермия, где упакован весь генетиче-

ский фонд отцовского происхождения,

т. е. происходит как бы «взаимное раз-

девание» и обнажение специфических антигенов.

В эксперименте на яйцеклетках

крольчих показано, что на первом эта-

пе оплодотворения требуется большое количество спермиев, причем на этом этапе вступать во взаимодействие с

яйцеклеткой для разрушения гиалуро-

новой кислоты могут спермии и других, достаточно отдаленных видов (барана, быка), сперма которых используется одновременно со спермой кролика

(И. И. Соколовская, 1947, 1948, 1957;

цит. по В. К. Милованову, 1962). Однако спермии животных других видов, обладая даже большей активностью по отношению к гиалуроновой кислоте, не могут проникнуть через прозрачную

оболочку яйцеклетки самки другого

вида. Это объясняется тем, что на поверхности прозрачной оболочки суще-

ствуют видоспецифические рецепторы,

позволяющие яйцеклетке взаимодей-

ствовать только с аллогенными спермиями.

В отличие от спермиев животных

отдаленных видов спермии своего вида

легко проходят сквозь прозрачную оболочку (после разрушения в ней гиалуроновой кислоты) и накапливаются в

околожелточном пространстве иногда

âбольшом количестве (до нескольких

десятков и даже сотен). Но, как прави-

ло, лишь один из спермиев, проникающий в яйцеклетку через прозрачную

оболочку, завершает процесс оплодот-

ворения, попадая внутрь яйца через его

желточную оболочку. Проникновение

âяйцеклетку одного спермия приводит к развитию «зональной реакции», в ре-

зультате которой меняется состав гли-

копротеинов (мукопротеинов) про-

зрачной оболочки. Она становится не-

проницаемой для других спермиев, тем самым предотвращая проникновение

их в яйцеклетку, что делает невозмож-

ной полиспермию. Это доказывает из-

бирательность яйцеклеток по отноше-

нию к спермиям и специфическое взаимодействие яйцеклетки и спермия по

принципу, аналогичному связыванию

антигена с антителом, что в настоящее

время не вызывает сомнений (презиго-

спермиев с сохранением оплодотворяющей способности в женском репродуктивном тракте у различных млекопитающих различен и составляет у мы-

шей 6...12 ч, у крыс 14, у быка, барана и

хряка 30...48, у кролика 30...40, у собаки 130, у жеребца 140...150 ч. Птицы при однократном осеменении продолжают нести оплодотворенные яйца в течение 3 нед.

У некоторых видов животных спер-

мии в естественных условиях могут длительное время пребывать в состоя-

нии анабиоза с сохранением фертиль-

ности, например у летучих мышей весь

зимний сезон, у черепах до 4 лет, а в половых путях некоторых змей до 6 лет. Сохранение спермы в состоянии ана-

биоза возможно (в искусственных ус-

ловиях при низкой температуре) и у млекопитающих, что широко используется для искусственного осеменения

животных.

В оплодотворенной яйцеклетке су-

ществуют, по крайней мере, три груп-

пы антигенов: отцовские, эмбриональные, появляющиеся лишь временно на

определенных этапах развития зароды-

ша, и макромолекулярные продукты

женских половых путей, приобретаю-

щие антигенность после контакта с компонентами спермы. Поэтому опло-

дотворенная яйцеклетка, а в последую-

щем эмбрион и плод становятся чуже-

родными для организма беременных, а

иммунная система спариваемых особей направлена против процесса воспроиз-

водства на всех его стадиях. Однако в

нормальных условиях беременные сам-

ки животных, обладающие иммуните-

том ко всему генетически чужеродному, прекрасно размножаются. Отрица-

тельное влияние иммунной системы

беременной особи на ее воспроизводи-

тельные качества отсутствует.

С самого начала попадания оплодотворенной яйцеклетки в матку ее

сохранение обеспечивается локальны-

ми механизмами подавления материнского иммунитета. У коров маточный секрет на 17-е сутки беременности содержит низкомолекулярные белки, спо-

собные угнетать пролиферативную ак-

тивность стимулированных лимфоцитов (П. А. Емельяненко, 1987). В последующем на протяжении всей беременности в периферической крови и в дренирующих матку сосудах возрас-

тает содержание Т-супрессоров при не-

существенном изменении содержания Т-хелперов и снижении цитотоксичес-

ких Т-лимфоцитов и естественных

киллеров.