Лекция 7. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ РАСТЕНИЙ
Генетическая инженерия - конструирование in vitro функционально активных генетических структур (рекомбинантных ДНК), или иначе - создание искусственных генетических программ. Генная инженерия растений позволяет целенаправленно, по заранее намеченной программе, экспериментально модифицировать геном растений внесением отдельных новых генов. Методами генетической инженерии нужные гены можно изолировать (клонировать) и целенаправленно переносить в клетки организма-реципиента.
Если традиционные методы селекции позволяют объединять в геноме гибридов генетическую информацию из близкородственных, скрещивающихся между собой, видов растений, то разработанные к настоящему времени генно-инженерные методы и подходы дают возможность перестраивать геном растения с использованием генетической информации из разных гетерологических систем: вирусов, бактерий, насекомых, животных и человека. Более того, при использовании генно-инженерных методов существенно расширяются возможности модификации генома и внутри растительного царства, снимающие естественные барьеры между отдаленными видами растений. В этом случае становится возможным переносить отдельные гены между систематически удаленными видами, например, из однодольных в геном двудольных растений.
Современные технологии создания трансгенных растений включают несколько основных этапов:
— выделение и клонирование генов, представляющих интерес для дальнейшего переноса в растительный геном, и создание генетических конструкций для экспрессии трансгенов в растениях;
— перенос созданных генетических конструкций в геном растений;
— оценка трансгенных растений по стабильности экспрессии перенесенных генов и отбор отдельных трансформантов для дальнейшей селекционной доработки и оценка их биобезопасности.
(Термины: клонирование – создание множества копий гена; экспрессия – работа гена, проявление активности гена, синтез под контролем гена белкового продукта).
Известно, что у бактерий гены располагаются не только в хромосоме, но и в плазмидах, представляющих собой небольшие кольцевые молекулы ДНК. Генные инженеры обрабатывают выделенные плазмиды специальными ферментами (рестриктазами), представляющими собой «молекулярные ножницы», разрезающие плазмидную ДНК на отдельные фрагменты, среди которых присутствует и фрагмент, включающий искомый ген. Фрагмент с искомым геном переносится в плазмиду кишечной палочки, так как именно в ней можно достаточно быстро получить много копий данного гена. Наработанные копии клонированного гена используются для создания генетических конструкций для экспрессии в клетках растений.
В общем виде генетические конструкции, создаваемые для планируемого переноса в геном растений различных генов, включают следующие необходимые элементы:
белок-кодирующую структурную последовательность (целевой ген);
промотор, узнаваемый РНК-полимеразой растительной клетки;
терминатор, узнаваемый РНК-полимеразой растительной клетки;
селективный или маркерный ген для отбора трансформантов в селективных условиях.
Основными элементами генетических конструкций являются непосредственно сами целевые гены, представляющие собой белок-кодирующие последовательности генов различного происхождения, а также их регуляторные элементы — промоторы.
В качестве регуляторных элементов в генетической инженерии растений в настоящее время используются три вида промоторов: конститутивные, тканеспецифичные и индуцибельные.
Конститутивныепромоторы, среди которых наиболее широко применяется промотор гена 35S-белка вируса мозаики цветной капусты, активны во всех тканях растения на протяжении всего жизненного цикла его развития.
Активность тканеспецифичныхпромоторов ограничивается функционированием генов в какой-либо определенной ткани растения. Например, промоторы генов запасных белков, таких как глютелин риса, легумин-B4 бобовых, напин капусты и γ-кафирин сорго ограничивают экспрессию трансгена в запасных тканях семян. Промотор гена пататина В33 направляет синтез мРНК только в клубнях картофеля.
Индуцибельныепромоторы активируют регулируемые ими гены в ответ на какой-нибудь сигнал: химическое воздействие, освещение, изменение температуры, заражение вирусом и т.п.
Необходимыми элементами в составе генетических конструкций для экспрессии целевых генов в тканях трансгенных растений являются селективные и репортерные гены. Среди селективных генов наиболее широко при создании трансгенных растений применяется генnptII, кодирующий синтез фермента неомицинфосфотрансферазы-II, что обеспечивает растительным клеткам устойчивость к антибиотикам канамицину и неомицину. Известен и ряд других селективных генов, среди которых можно назвать ген устойчивости к антибиотику гигромицинуhpt, а также гены, обеспечивающие устойчивость к ряду различных гербицидов.
Репортерные геныиспользуются для быстрого выявления временных и пространственных особенностей экспрессии данного конкретного гена. Репортерные гены позволяют определить визуально, в каких тканях растения происходит экспрессия перенесенного гена. Детекция белков репортерных генов основана, как правило, на цветной окраске, флюоресценции или люминесценции, которой могут обладать как сами белки, так и продукты их специфического ферментативного воздействия.
Способы переноса генетической информации
В настоящее время существует два основных способа переноса генетических конструкций в геном высших растений. Один из них основан на природной способности почвенной бактерии Agrobacterium tumefaciens переносить часть своей ДНК в растительный геном. Второй подход заключается в непосредственном переносе экзогенной ДНК в растительную клетку (при помощи генной пушки, методом электропорации протопластов, микроинъекций и т.д.).
Наиболее распространенным методом прямого переноса ДНК является бомбардировка растительных тканей микрочастицами металлов (биобаллистика). Этот метод впервые был использован для получения трансгенных растений в 1987 году. Метод заключается в обстреливании клеток растений микрочастицами (диаметр 0,5—1 мкм) вольфрама или золота с адсорбированными на их поверхности молекулами ДНК. Для этих целей необходимо использование специального оборудования —генной пушки. В качестве объекта для бомбардировки применяют, как правило, каллусы или тканевые экспланты (меристемы).
Электропорация протопластов. Основным условием для широкого применения методов прямой трансформации протопластов является наличие надежных, хорошо разработанных систем регенерации полноценных растений в культуре in vitro. При использовании этого метода фрагменты экзогенной ДНК поступают в протопласты (растительные клетки, лишенные целлюлозных оболочек) через поры в липидной оболочке, образованные действием короткого электрического импульса. Образование таких пор обратимо при условии, что сила приложенного электрического поля не превышает некоторого порогового значения. В противном случае, наступает массовая гибель клеток.
Использование полиэтиленгликоля (ПЭГ) для трансформации протопластов основано на его способности стимулировать в присутствии двухвалентных катионов преципитацию ДНК на поверхности мембраны с последующим поглощением фрагментов экзогенной ДНК посредством эндоцитоза.
Использование карбида кремния для трансформации клеток растений, каллусов и растительных эксплантов является очень простым и дешевым методом. Данный метод состоит в интенсивном совместном перемешивании (на шейкере) кристаллов карбида кальция с растительным материалом и фрагментами экзогенной ДНК, предназначенной для введения в клетки. При перемешивании кристаллы карбида кремния прокалывают целлюлозные оболочки, благодаря чему ДНК проникает в клетки и может интегрироваться в растительный геном. Основной недостаток данного метода состоит в низкой эффективности, обусловленной гибелью клеток при поранении.
Бактерии рода Agrobacterium – это почвенные бактерии, отдельные штаммы которых являются патогенными для растений и трансформируют их клетки. Круг растений-хозяев для патогенов рода Agrobacterium достаточно широк — более 600 видов двудольных, несколько видов однодольных и около 40 видов голосеменных растений. Почвенная бактерия A.tumefaciens способна вызывать в местах поранения у двудольных растений опухолевый рост зараженных клеток. Патогенные свойства почвенной бактерии A. tumefaciens связаны с наличием большой (около 200 т.п.н.) Ti (tumor inducing)–плазмиды. Геном A. tumefaciens представлен одной хромосомой и множеством (200—250) кольцевых фрагментов ДНК (плазмид), разного размера. Плазмиды большого размера (200—250т.п.н.) получили название мегаплазмид, среди которых Ti-плазмида выполняет роль ин-фицирующего фактора заболевания «корончатые галлы».
Основными составными частями Ti-плазмиды являются область Т-ДНК, гены катаболизма ферментов, vir-область и сайт инициации репликации в A.tumefaciens. Часть плазмиды, способная переноситься в растительную клетку и встраиваться в ядерный геном, получила специальное название - Т-ДНК (от английского transferred DNA). Остальная часть плазмиды, не принадлежащая к Т-ДНК, называется векторной ДНК.
Фрагмент Т-ДНК фланкирован прямыми повторами длиной 25 п.н. (правая и левая пограничные последовательности) и содержит гены двух типов: онкогены, кодирующие ферменты биосинтеза ростовых факторов растения (ауксинов и цитокининов), и ген синтеза опинов. Опухолевый рост инфицированных клеток, вызванный экспрессией ростовых факторов, создает экологическую нишу, а секретируемые опины служат источником углерода и азота для агробактерий. Помимо Т-ДНК Ti-плазмида содержит гены катаболизма опинов и гены вирулентности, необходимые для ее переноса в растительную клетку и стабильной интеграции в ядерный геном. В процессе агробактериального заражения фрагмент Ti-плазмиды (Т-ДНК) переносится в растительную клетку и интегрируется с ядерным геномом. Перенос осуществляется координированным действием генов (как правило, представленными шестью оперонами), расположенными в vir-области мегаплазмиды. На основе Ti-плазмиды A.tumefaciens была сконструирована серия так называемых «обезоруженных» (не содержащих онкогены) векторов, что положило начало прикладной генетической инженерии.
Наследование трансгенов у трансгенных растений
В терминах классической генетики проявление перенесенного гена у трансгенных растений соответствует доминантной мутации при полном доминировании, а его наследование в ряду поколений подчиняется классическим законам Менделя. Придерживаясь общепринятых обозначений, генотип трансгенного растения с одной вставке Т-ДНК на геном может быть записан как +/-, где «+» обозначает наличие вставки чужеродного гена и «-» — ее отсутствие в соответствующем локусе гомологичной пары хромосом. Соответственно, при встраивании маркерного гена nptII в составе одной Т-ДНК вставки на ядерный геном генотип исходного трансформанта можно записать как npt+/npt-. При самоопылении такого трансформанта перенесенный ген nptII будет комбинировать в составе гамет и среди потомков будут выявляться три генотипических класса в соотношении: 1npt+/npt+ : 2npt+/npt-: 1 npt-/npt-.
Антибиотик канамицин в растительной клетке нарушает процесс фотосинтеза и вызывает гибель растений. Перенос бактериального гена, кодирующего неомицинфосфотрансферазу II, обеспечивает устойчивость трансформантов к этому антибиотику, благодаря его инактивации. Проведение теста на устойчивость трансгенных растений к канамицину позволяет отобрать трансгенные растения из множества регенерантов. Если в геном растения встроилась одна копия переносимого гена, то в потомстве соотношение трансгенных и нетрансгенных растений будет 3:1, если две копии – 15:1. Однако следует учитывать, что в результате перестроек растительной ДНК, часть введенных генов может потеряться или модифицироваться.
Перенесенные в геном трансгенного растения гены проявляют разный уровень экспрессии, зависящий от числа вставок, интегрированных в одно место генома, от места встраивания трансгена и окружающих его собственных генов растения. Трансгены, организованные в виде кластеров нескольких тесно сцепленных Т-ДНК фрагментов, не только проявляют низкий уровень экспрессии, но и снижают уровень экспрессии других гомологичных генов при взаимодействии в геноме гибридного растения.
При создании трансгенных растений в коммерческих целях проблема вариабельности по экспрессии перенесенных генов преодолевается получением большого числа независимых трансформантов. Полученные растения оцениваются индивидуально и отбираются генотипы с высокой (требуемой) экспрессией перенесенных генов.
Трансгенные растения, используемые в сельском хозяйстве
За последние годы кроме маркерных генов изолированы, клонированы и перенесены в геномы растений чужеродные гены, определяющие устойчивость к гербицидам, насекомым-вредителям, вирусам, а также гены, ответственные за синтез запасных белков. Большинство чужеродных генов в клетках растения экспрессируется нормально, стабильно наследуется и не влияет негативно на фенотип растения-хозяина и его потомства.
Первые трансгенные продукты появились в продаже в США в 1994 г., после прохождения всех необходимых тестов на токсичность, аллергенность, мутагенность и
т.д. Это были томаты Flavr Savr с замедленным созреванием, созданные фирмой «Calgen», а также гербицидустойчивая соя компании «Monsanto». Уже через 2 года биотехнологические фирмы поставили на рынок целый ряд генетически измененных растений: томатов, кукурузы, картофеля, табака, сои, рапса, кабачков, редиса,
хлопчатника. Наиболее остро стоит вопрос о получении растений, устойчивых к вредителям сельского хозяйства. Традиционно для этого используют ген bt, продуктом которого является бактериальный токсинBacillus thuringiensis. Эта тюрингская бактерия продуцирует крупный белок (протоксин), контролируемый геномbt, который,
попадая в кишечник личинок насекомых, разрушается под действием ферментов, а его фрагмент (эндотоксин) приводит к их гибели. В настоящее время уже синтезирован искусственный ген bt, конструкция с которым более эффективна, а сами трансгенные растения обладают широким спектром устойчивости к насекомым. Трансгенные
растения картофеля, хлопка, кукурузы с геном bt уже производятся фирмами «Monsanto», «Ciba Seeds» и продаются на рынках мира, хотя дискуссии о безопасности их использовании еще не закончены.
Получение гербицидустойчивых культурных растений позволяет удешевить их производство. По новой технологии обработку полей неселективными гербицидами можно проводить весь сезон, что улучшает результаты их применения. Но это направление генной инженерии таит ряд экологических опасностей: накопление гербицидов (или продуктов их детоксикации) в сельскохозяйственных продуктах; возможность переноса генов устойчивости к гербицидам из культивируемых растений в сорняки.
Трансгенные растения как биофабрики для производства белков медицинского назначения.
Получение рекомбинантных белков для терапевтических целей — одно из наиболее приоритетных направлений современной биотехнологии. Традиционно для этих целей используются системы экспрессии рекомбинантных белков в E.coli, дрожжах и клетках млекопитающих. Успехи в области генетической инженерии и расшифровка последовательностей растительных геномов открыли новые возможности в использовании растений для получения рекомбинантных белков терапевтического назначения.
Растения для производства рекомбинантных белков для фармакологии имеют ряд преимуществ: экономичность, возможность широкомасштабного производства при сохранении умеренной стоимости продукта, способность синтезировать многие сложные белки человека и животных в правильно-свернутой и модифициро-ванной форме, отсутствие проблем, связанных с безопасностью заражения вирусами животных. В ряде случаев нет необходимости в очистке продуцируемого рекомбинантного полипептида, т.к. белки, накапливаемые в традиционно используемых в питании растений (морковь, салат, капуста и др.), могут вводиться в организм теплокровных и человека перорально в составе растительных тканей. Так как слизистая оболочка желудочно-кишечного тракта функционирует как часть иммунной системы организма, а функцию защитной капсулы, ограждающей белок от разрушительного действия желудочных ферментов, может выполнять клеточная стенка трансгенных растений, то такие растения могут быть использованы в качестве так называемых «съедобных» вакцин. Растительные клетки так же можно использовать для доставки терапевтических белков, оказывающих прямое регуляторное воздействие на клетки иммунной системы желудочно-кишечного тракта.