М12-Ферменты_бактерий

ГБОУ ВПО «Уральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации Кафедра микробиологии, вирусологии и иммунологии

Методические указания №12 к практическим занятиям для студентов

ООП специальности 060101.65 Лечебное дело Дисциплина С2.Б.10 Микробиология, вирусология

1.Тема: Ферменты бактерий. Изучение ферментативной активности

микроорганизмов.

2.Цели занятия: Изучить ферменты бактерий и методы изучения ферментативной активности бактерий.

3.Задачи занятия:

3.1.Изучить ферменты бактерий.

3.2.Ознакомиться с методами изучения ферментативной активности бактерий.

4. Продолжительность занятия в академических часах: 3 часа.

2

5.Контрольные вопросы по теме:

5.1.Ферменты бактерий.

5.2.Методы определения ферментативной активности микробов.

6.Задания и методические указания к их выполнению.

На занятии студенту необходимо выполнить:

6.1.Ответить на вопросы преподавателя.

6.2.Принять участие в обсуждении изучаемых вопросов.

6.3.Изучить ферменты бактерий и методы определения ферментативной активности.

6.4.Выполнить самостоятельную работу.

Теоретическая справка.

Ферменты бактерий представляют собой либо только белок с высокой молекулярной массой, либо состоят из белка (апофермента), связанного с кофактором (коферментом). Кофермент может быть низкомолекулярным неорганическим (металл) или органическим веществом.

Все ферменты в зависимости от типа катализируемых реакций делятся на

6классов:

1.Оксидоредуктазы – катализируют окислительно-восстановительные реакции: дегидрогеназы (НАД, НАДФ, ФАД), каталаза, цитохромы.

2.Трансферазы – переносят группы атомов между молекулами от одних соединений к другим: ацетилтрансфераза, фосфотрансфераза, аминотрансфераза.

3.Гидролазы – переносят функциональные группы с участием воды, расщепляют различные соединения: пептидгидролазы, глюкозидаза, амилазы, эстеразы, липаза, фосфатаза.

4.Лиазы – без участия воды отщепляют от субстрата химические группы: пируватдекарбоксилаза, альдолаза.

5.Изомеразы – переносят группы внутри молекул с образованием изомерных форм: триизофосфатизомераза, глюкозофосфатизомераза.

6.Лигазы (синтетазы) – объединяют две молекулы с использованием энергии АТФ: аспарагинсинтетаза, кокарбоксилазы.

Взависимости от места функционирования выделяют эндоферменты и экзоферменты.

Эндоферменты находятся внутри бактериальной клетки, катализируют внутриклеточные процессы обмена веществ.

Экзоферменты синтезируются внутри бактериальной клетки, после чего выделяются во внешнюю среду и выполняют функцию расщепления сложных питательных веществ.

Некоторые экзоферменты являются ферментами агрессии, так как они способствуют проникновению и распространению бактерий в тканях организма хозяина и ослаблению его защитных свойств. К ферментам агрессии относятся: гиалуронидаза, нейраминидаза, коллагеназа, протеазы, фибринолизин и др.

Конститутивные ферменты – это ферменты, которые синтезируются клеткой с постоянной скоростью, независимо от наличия субстрата в среде. Индуцибельные (адаптивные) ферменты образуются только в присутствии

3

соответствующего субстрата в среде (бета-галактозидаза синтезируется только при добавлении в питательную среду лактозы).

Методы определения ферментативной активности микробов. При идентификации выделенной чистой культуры бактерий определяют ферментативную активность по следующим свойствам:

-сахаролитическая активность;

-протеолитическая активность;

-липолитическая активность;

-каталазная активность;

-ферменты патогенности (агрессии).

Ферменты, разлагающие углеводы (сахаролитические ферменты)

определяют на дифференциально-диагностических средах Гисса. В состав сред Гисса входит 1% пептонная вода, индикатор, поплавок для улавливания газа и 0,5% одного из углеводов (глюкоза, лактоза, мальтоза, маннит, сахароза, крахмал и т.д.). При ферментации углевода до кислоты меняется только цвет среды. При ферментации углевода до кислоты и газа меняется цвет среды и в поплавке накапливаются пузырьки газа. В качестве индикаторов используют индикатор Андреде (кислый фуксин в растворе едкого натра), индикатор ВР (смесь водного голубого и розоловой кислоты), бромтимоловый синий и др. Среды с реактивом Андреде при ферментации углеводов меняют окраску на красный цвет. Среды с индикатором ВР в кислой среде становятся синими, а в щелочной среде – красными.

Протеолитическая активность бактерий оценивается по расщеплению белка с образованием индола (расщепление триптофана), сероводорода

(разложение серосодержащих аминокислот – цистина, цистеина, метионина) и аммиака (разложение фенилаланина). Для выявления этих газообразных веществ делают посевы чистой культуры бактерий в мясо-пептонный бульон или пептонную воду в пробирки, под пробку которых помещают полоски бумаги, пропитанные индикаторами. При наличии продуктов расщепления меняется цвет соответствующего индикатора.

Индол: индикатор – щавелевая кислота; первоначально белая бумага окрашивается в розовый цвет.

Аммиак: индикатор – лакмус; первоначально розовая бумага окрашивается в синий цвет.

Сероводород; индикатор – ацетат свинца; первоначально белая бумага окрашивается в черный цвет (образование сульфата свинца).

Протеолитическую активность бактерий можно определить путем посева чистой культуры уколом в столбик 10-20% желатина по наличию и характеру разжижения среды (в виде перевернутой елочки, гвоздя, воронки, наполненной разжиженным желатином).

Протеолитическую активность бактерий можно определить путем посева чистой культуры в столбик свернутой сыворотки по ее разжижению.

Протеолитическую активность бактерий можно определить путем посева чистой культуры на молочный агар Эйкмана по образованию зон просветления (протеолиза) вокруг колоний.

Определение каталазы проводят следующим образом: на предметное стекло наносят исследуемую культуру и добавляют каплю 3% раствора перекиси

4

водорода. Выделение пузырьков кислорода указывает на наличие у микроба каталазы.

Определение ДНКазы проводят на агаре, содержащем ДНК в конечной концентрации и хлорид кальция. После выращивания наносят раствор соляной кислоты. При положительной реакции вокруг колоний на мутном фоне образуется прозрачная зона деполимеризованной ДНК.

Определение плазмокоагулазы и фибринолизина проводят путем внесения культуры в плазму крови животных (кроликов). При наличии коагулазы через 0,5-4 часа в плазме образуется плотный сгусток. При наличии фибринолитической активности через 20 часов сгусток растворяется.

Определение лецитиназы проводят на агаре, содержащем яичный желток (среда Чистовича). При положительной реакции вокруг колоний возникает зона опалесценции с радужным венчиком.

Определение липазы проводят на агаре, содержащем яичный желток или 5% кукурузного масла. При положительном результате при косом освещении наблюдают перламутровый блестящий ореол.

После обсуждения теоретических вопросов преподаватель объясняет порядок выполнения самостоятельной работы.

Самостоятельная работа: учет результатов изучения сахаролитической активности бактерий с использованием демонстрационных “пестрых рядов”.

7. Оценивание знаний, умений, навыков по теме занятия:

Ответы на вопросы и активность на занятии оцениваются по 5-балльной системе.

8. Литература для подготовки:

8.1.Основная:

1.Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: учебник для студентов медицинских вузов. Под ред. А.А. Воробьева. Учебники и учеб. пособия для высшей школы. Издательство: Медицинское информационное агентство, 2012. – 702 с.

2.Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. В 2-х т. Том 1 : учеб. по дисциплине «Микробиология, вирусология и иммунология» для студентов учреждений высш. проф. образования, обучающихся по специальностям 060101.65 «Лечеб. дело», 060103.65 «Педиатрия», 060104.65 «Медико-профилакт. дело» / под ред. В.В. Зверева, М.Н. Бойченко. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2011. – 448 с.: ил.

3.Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. В 2-х т. Том 2 : учеб. по дисциплине «Микробиология, вирусология и иммунология» для студентов учреждений высш. проф. образования, обучающихся по специальностям 060101.65 «Лечеб. дело», 060103.65 «Педиатрия», 060104.65 «Медико-профилакт. дело» / под ред. В.В. Зверева, М.Н. Бойченко. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2011. – 480 с.: ил.

8.2.Дополнительная:

1.Коротяев А.И. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология: Учебник для студентов мед. вузов / А.И. Коротяев, С.А. Бабичев. - 5-е изд., испр. и

доп. – СПб.: СпецЛит, 2012. – 759 с.: ил.

5

2.Медицинская микробиология: учебник. 4-е изд. Поздеев О.К. / Под ред. В.И. Покровского. – 2010. – 768 с.

3.Руководство по медицинской микробиологии. Общая и санитарная микробиология. Книга 1 / Колл. авторов // Под редакцией Лабинской А.С., Волиной Е.Г. – М.: Издательство БИНОМ, 2008. – 1080 с.: ил.

Методические указания переработаны и дополнены профессором Литусовым Н.В., аспирантом кафедры Зорниковым Д.Л.

Обсуждены на заседании кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии.