Иммунка все лекции / Иммунология ТЕ ЧТО НАДО / синтез антител

Синтез антител in vitro и гибридомы

В течение многих лет делались попытки разработать такие методы культивирования лимфоидных иммунокомпетентных клеток, которые бы позволили инициировать иммунный от­вет в виде выработки антител in vitro. Впервые это удалось в 1966 г. Р. Мишелю и Р. Даттону для культуры селезеноч­ных клеток. В отличие от ранее существовавших методов, ко­торые позволили получать синтез антител in vitro клетками, изъятыми из иммунизированного животного, Р. Мишель и Р. Даттон сумели создать такие условия культивирования, в которых весь процесс—от восприятия антигенного стимула до продукции антител, проходил in vitro. Этот метод дал возможность вскрыть ряд клеточных закономерностей антителогенеза, обнаружить молекулярные медиаторы межкле­точных взаимодействий и т. д. Однако проблему наработки больших количеств антител этот метод не решил. Во-первых, потому, что лимфоидные клетки не могут длительно культи­вироваться и после нескольких делений гибнут. Во-вторых, потому, что среди популяции лимфоидных, например селезе­ночных, клеток содержатся представители самых различных клонов лимфоцитов, предетерминированных к синтезу самых различных по специфичности антител. Вот почему после им­мунизации даже монодетерминантным антигеном в пуле иммуноглобулинов, синтезируемых совокупностью клеток, поми­мо искомых антител, содержатся сотни или тысячи антител иных специфичностей. Для получения антител одной специ­фичности (моноклональных) необходимо культивировать мо­ноклон, т. е. культуру антителопродуцентов, происходящих из одного лимфоцита. Создание бесконечно живущей культуры моноклона решает одновременно две задачи — получение мо­носпецифических моноклональных антител и наработку их в неограниченном количестве. Это казалось невозможным, так как только раковые клетки обладают способностью к неогра­ниченному культивированию in vitro. Нормальные клетки после серии делений погибают (эффект Хейфлика). Вместе с тем примеры существования моноклональных антител хо­рошо известны. Выше упоминалось о плазмацитомах—лим­фоидных опухолях, при которых в организме разрастается один клон антителопродуцентов и синтезируемые им миеломные иммуноглобулины представляют собой моноклональные антитела против какой-то найденной или не найденной анти­генной детерминанты. При этом плазмацитомные клетки об­ладают способностью бесконечно культивироваться in vitro.

В 1975 г. Г. Кёлер и К. Мильштейн разработали методику получения клеточных гибридов — гибридом от слияния нор­мальных лимфоцитов иммунизированных животных с культи­вируемыми в питательной среде клетками миеломных штам­мов. Были использованы такие штаммы, которые не содержит фермента гипоксантинфосфорибозилтрансферазы, вслед­ствие чего погибают в селективной питательной среде, содер­жащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин (ГАТ). Лимфо­циты в этой среде не гибнут. Слияние лимфоцитов с миеломными клетками осуществляется с помощью полиэтиленгликоля. Слившиеся гибридомные клетки получают от лимфоцита способность синтезировать определенное антитело и способ­ность выживать в среде с ГАТ. От миеломного партнера они получат способность бесконечно размножаться in vitro. Нако­пившийся гибридомный клон может быть размножен. Синте­зируемые им моноклональные антитела могут быть получены в неограниченном количестве. По всем параметрам антитела, вырабатываемые одним клоном, идентичны — по классу моле­кулы, по ее типу и по специфичности. Она взаимодействует только с одним антигеном. Таким образом полученный в про­бирке, во флаконе или в клеточном реакторе препарат может служить идеальным по специфичности реагентом на ту или иную органическую субстанцию, идеальным диагностическим или лечебным средством. Набор специфических реагентов, ко­торый может быть получен, неограничен. Это могут быть ан­титела против белков крови и тканей, против специфических антигенов органов, раковых и нормальных клеток, против ви­русов, бактерий, против ряда химических соединений и др.

За несколько лет проблема изучения и практического ис­пользования гибридом проделала взрывоподобное развитие.

Сотни исследователей в различных странах подключились к ее разработке. Ближайшее будущее обещает создание фирм или фабрик по наработке моноклональных антител в качестве уникальных реагентов, диагностических и лечебных препа­ратов.

Конечно, получение лимфоцитарных гибридом дело не прос­тое. Оно включает в себя несколько этапов (рис. 18): а) по­лучение миеломной линии; б) получение селезеночных кле­ток от иммунизированного организма; в) создание в культуре условий для того, чтобы хотя бы некоторые клетки одной и другой популяций могли осуществить слияние; г) выделение слившихся клеток и накопление их клонов; д) отбор интере­сующего клона, его накопление и использование. Накопление клона осуществляют in vitro или путем введения животным. При этом на всех этапах образцы клеток необходимо консер­вировать в жидком азоте, чтобы в любое время можно было вернуться к любому этапу и сохранить на будущее нужные клоны. В качестве миеломных клеток чаще всего используют мышиные или крысиные клеточные линии.

С помощью моноклональных антител уже внесен огромный вклад в науку. Проанализирована структура и генетика иммуноглобулинов, открыты и исследованы рецепторы лимфоци­тов, получены реагенты на субпопуляции лимфоцитов и опу­холевых клеток, проведены эксперименты по лечению рака крови, приготовлены моноклональные антитела против ряда микроорганизмов и др.

Гибридомы создаются не только на основе В-лимфоцитов, обеспечивающих возникновение культур, синтезирующих мо­ноклональные антитела, но и на основе Т-лимфоцитов. Уже созданы культуры Т-гибридом, синтезирующие те или иные лимфокины. Например, гибридома 123, вырабатывающая CFUs-SA—гуморальный фактор, стимулирующий полипотентные кроветворные стволовые клетки к пролиферации (см. главу Х и раздел «Взаимодействие лимфоцитов с кроветвор­ными стволовыми клетками» в главе VII).

2