Клеточные технологии в медицине.

История культивирования животных клеток. Методики и подходы.

Представление о том, что клетки тканей животных можно выделить из организма и затем создать условия для роста и воспроизводства их in vitro возникла на базе концепции, принадлежащей Клоду Бернару: "Пробуждение уверенности в том, что животные живут в двух средах - millieu exterieur (внешняя среда), в которой существует организм, и millieu interieur, в котором существуют тканевые элементы организма". Не только живые организмы способны сохранять постоянство внутренних условий, вне зависимости от изменений в окружающей среде. Клетка вне организма животного также будет стремиться поддерживать свои внутренние условия. Позднее, в 1885 году, У. Ру показал возможность сохранения вне организма живых тканей на практике, а уже в 1897 г., Лёб поддерживал в жизнеспособном состоянии клетки крови и соединительной ткани в пробирках с сывороткой и плазмой крови. Впервые клоны клеток в культуре из одиночной клетки были получены Эрлом с сотрудниками в 1948 году. В настоящее время можно культивировать клетки практически всех тканей и органов человека, животных и растений.

Культивирование органов. История исследований в области культивирования органов и тканей. Основные методы культивирования органов.

В соответствии с целями и задачами экспериментальной работы выделяют два направления культивирования животных клеток: - культуры клеток (культура уже разобщенных клеток) и культуры органов и тканей (органные культуры). В зависимости от соотношения с поддерживающим субстратом клеточные культуры делятся на: однослойные и суспензионные. Тканевая культура - это собственно культура тканей, гистокультура, состоящая из эксплантата и зоны роста. Органная культура - культура, в которой эмбрионы, зачатки органов, целые органы или эксплантаты поддерживаются таким образом, чтобы обеспечивает дифференцировку и /или сохранение структуры и/ либо функции в этих условиях. Основные этапы техники культивирования органов:

1. "Техника часового стекла" (Фелл, Робинсоном,1929);

2. Метод часовых стекол с агаровым сгустком (Вольф,Хафен, 1952);

3. Модифицированный метод Троувелла (Ласнитски, 1989).

Введение клеток в культуру, их происхождение. Характеристика клеток

культивируемых in vitro.

Культура, источником которой являются органы, эксплантаты или клетки, непосредственно извлеченные из организма (опухолевые клетки, образованные культивировавшимися клетками, введенными животным), называется первичной культурой. Пассированная культура - культура, подвергавшаяся переносу из одного сосуда в другой. Пассирование обеспечивает возможность продления существования культуры, возможность клонирования, исследования и сохранения свойств клеток. После нескольких пересевов линия клеток либо гибнет, либо трансформируется и становится постоянной клеточной линией. Нормальные клетки могут трансформироваться в постоянную линию, не становясь при этом злокачественными. Свойством "бессмертности" обладают в основном клетки, полученные из опухолей. Культуры, полученные из эмбриональных тканей, характеризуются лучшей выживаемостью и более активным ростом по сравнению с соответствующими зрелыми тканями. Получение первичных культур клеток взрослых тканей и их размножение является сложной задачей, продолжительность жизни таких культур, как правило, невелика.

Изменение ростовых свойств культивируемых клеток называется трансформацией. Трансформация — наследуемое (необратимое) изменение свойств культивируемых клеток, вызванное известными факторами, например, новым генетическим материалом, химическими агентами, облучением или неизвестными причинами. Трансформированные клетки способны расти в условиях, в которых геометрические характеристики, а именно отношение площади поверхности к объему менее благоприятны. Трансформация может быть или вирусной, или «спонтанной». Старение характерно для клеток, имеющих ограниченный потенциал пролиферации, то есть низкую плотность насыщения при идеальных условиях культивирования. Примером могут служить линии диплоидных клеток человека. Повышенная способность к росту трансформированных клеток означает, что трансформация преобладает над процессом старения. Известно, что феномен клеточного старения развивается по достижении клетками предела Хейфлика (Hayflick, Moorhead, 1961). Трансформированные клетки не имеют ограниченной продолжительности жизни, и это обусловливает их преимущество в биотехнологии.

Питательные среды. Требования, предъявляемые к питательным средам

и условиям культивирования клеток животных и человека.

Клетки после извлечения их из ткани или организма помещают в культуральную среду, которая должна обеспечивать все внешние условия, которые клетки имели in vivo. Это обеспечивает выживание клеток, их пролиферацию и дифференцировку. Культуры клеток животных и человека предъявляют определенные требования к жидкой (питательная среда), газообразной (концентрация газов) и твердой (поверхность субстрата) фазе. Питательная среда представляет собой раствор определенного состава, к которому добавляются компоненты биологического происхождения (добавки плазмы, сыворотки крови, тканевые экстракты и т.д.). Традиционно среда для культивирования состоит из питательных веществ и витаминов в забуференном солевом растворе. Ключевым компонентом является сыворотка животных, например, эмбриональная бычья сыворотка. Без такой добавки наибольшая часть культивируемых клеток не будут воспроизводить собственную ДНК и, следовательно, не будут пролиферировать.