Методические указания к практической работе

Продолжительность занятия: 3 академических часа (135 минут)

Место проведения занятия: учебная аудитория

Материально-техническое оснащение – таблицы, стенды, микроскопы, микропрепараты, вакцины

Хронометраж практического занятия:

1. Вводное слово преподавателя – 5 мин

2. Проверка исходного уровня знаний (тест-контроль) – 15 мин

3. Разбор теоретических вопросов по теме – 80 мин

1. Классификация сальмонелл

2. Антигенная структур сальмонелл.

3. Морфологическая и культуральная характеристика возбудителей брюшного тифа, паратифов

4. Эпидемиология брюшного тифа и паратифов

5. Патогенез брюшного тифа

6. Микробиологическая диагностика брюшного тифа

7. Специфическая профилактика и терапия брюшного тифа

4. Практическая работа – 35 мин

Практическая работа

1. Изучение мазков из чистых культур сальмонелл, окрашенных по Граму (зарисовать)

а) мазок из чистой культуры сальмонелл брюшного тифа, окрашенный по Граму. В мазке из чистой культуры видны прямые с закругленными концами грамотрицательные палочки, расположенные беспорядочно.

б) мазок из чистой культуры сальмонелл паратифа А. В мазке видны прямые грамотрицательные палочки с закругленными концами, расположенные одиночно, бессистемно.

в) мазок из чистой культуры сальмонелл Шоттмюллера. В мазке из чистой культуры сальмонелл паратифа В, окрашенных по Граму, видны прямые, с закругленными концами грамотрицательные палочки, расположенные бессистемно.

2. Изучение роста тифозных и паратифозных бактерий на среде Эндо (зарисовать)

Тифозные и паратифозные бактерии вырастают бесцветными. Среда Эндо относится к дифференциально-диагностическим средам. В ее состав кроме питательной основы входят лактоза и индикатор – основной фуксин, обесцвеченный раствором сульфита натрия, образуется бесцветная фуксинсернистая кислота . Тифозные и паратифозные бактерии не сбраживают лактозу, поэтому среду Эндо не изменяют и колонии на среде вырастают бесцветными.

3. Изучение ферментативных свойств на пестром ряду с посевом тифозных и паратифозных бактерий по таблице (записать в тетрадь табл.6)

В состав пестрых рядов входят пептонная вода, углевод (0,5- 1%) и индикатор бромкрезолпурпур. В среду опущен поплавок для улавливания газа. При расщеплении углевода образуется кислота (К) (среда из фиолетовой становится желтой или красной) и газ (КГ), среда не только изменяет цвет, но и в поплавке накапливается газ. Для обнаружения сероводорода под пробку помещают фильтровальную бумажку, пропитанную уксусно-кислым свинцом. При положительной реакции на сероводород бумажка чернеет, так как образуется сернистый свинец. Для обнаружения индола используют бумажку, пропитанную щавелевой кислотой. Если при расщеплении пептона образуется индол, бумажка розовеет.

Таблица 6

Ферментативные свойства s.Typhi, s. ParatyphiA и s. Schottmuelleri

Пестрый ряд Вид сальмонеллы	Ферментация					Образование
	Лактоза	Глюкоза	Мальтоза	Маннит	Сахароза	Индол	Сероводород
S.typhi	-	к	к	к	-	-	+
S. paratyphi A	-	кг	кг	кг	-	-	-
S. schottmuelleri	-	кг	кг	кг	-	-	+

Примечание: К – образование кислоты; КГ – образование кислоты и газа; (+) – образование газа; (-) – отсутствие ферментации или образования

4. Изучение посева по методу Клодницкого (зарисовать)

Сделан посев 10 мл крови в 100 мл стерильной дистиллиро-

ванной воды. В воде происходит гемолиз, образуется лаковая кровь, которая служит питательной средой для возбудителей, на ней тифозные бактерии вырастают не хуже, чем на среде с желчью.

5. Изучение реакции непрямой Ви-гемагглютинации по схеме (записать в тетрадь табл.7)

Эта реакция используется для обнаружения Vi-антител как у больных людей, так и бактерионосителей. На присутствие возбудителей брюшного тифа организм отвечает выработкой антител, в том числе Vi-антител, поэтому определение этих антител имеет большое эпидемиологическое значение, т.к. позволяет выявить бактерионосителей.

На эритроциты человека или животных, обработанные специальным методом, адсорбирован Vi-антиген, и эти эритроциты приобретают способность агглютинироваться соответствующими Ви-антителами. Эритроциты с адсорбированными на их поверхности антигенами называет эритроцитарными диагностикумами. Ставят реакцию Vi-гемагглютинации в пробирках или в пластмассовых пластинах по схеме (таблица):

Содержимое перемешивают и ставят в термостат на 2 часа и оставляют при комнатной температуре до следующего дня. Учитыва­ют с контроля. В контроле Vi-сыворотки реакция должна быть поло­жительной, в контроле диагностикума – отрицательной. Реакцию оценивают по степени агглютинации диагностикума:

(++++) – эритроциты полностью агглютинированы, осадок на дне

лун­ки в виде зонтика;

(+++) – "зонтик" меньше, не все эритроциты агглютинировались;

(++) – "зонтик" маленький, на дне лунки осадок из неагглютини-

рованных эритроцитов;

(–) – реакция отрицательная, эритроциты не агглютинировались и

осели на дно лунки в виде пуговки.

6. Изучение посевов испражнений больного брюшным тифом на средах Эндо и Мюллера (зарисовать)

а) на среде Эндо выросли колонии кишечной палочки красного цвета и среди них бесцветные колонки тифозных или паратифозных бактерий.

б) посев на среду Мюллера (в пробирке) способствует подавлению роста кишечных палочек и накоплению тифозных и паратифозных бак­терий, потому что среда Мюллера, кроме питательной основы (МПБ) содержит раствор йода, гипосульфита натрия, химически чистого ме­ла. При взаимодействии этих веществ образуется тетратионат натрия, являющийся фактором, подавляющим рост кишечной палочки, но не препятствующий росту и размножению тифозно-паратифозных бактерий.

Таблица 7

Схема постановки реакции непрямой Vi-гемагглютинации

Разведение сыворотки Компоненты реакции, мл	1	2	3	4	5	6	7
	1:10	1:20	1:40	1:80	1:160	Контроль сыворотки	Контроль антигена
Физ. раствор	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	-	0,5
Сыворотка больного 1:5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5 0,5 мл. в дез. р-вор	0,5Ви сыворотки	-
Эритроцитарный диагностикум	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25

7. Изучение этапов ранней диагностики брюшного тифа (метод гемокультуры) (оформить в тетради протокол)

10–20 мл стерильно взятой из локтевой вены крови засевают на 100–200 мл 10% желчного бульона или среды Рапопорт. Среда Ра­попорт позволяет уже на второй день дифференцировать тифозные бак­терии от паратифозных. Паратифозные бактерии разлагают глюкозу, входящую в состав среды Рапопорт с образованием кислоты и газа, которые обнаруживают при помощи «поплавков». Тифозные бактерии разлагают глюкозу только до кислоты.

7.1. Изучить характер роста на 10% желчном бульоне, в который на­кануне была засеяна кровь больного. Позже описания посевов из фла­кона сделать высев петлей на среду Эндо. Посевы поместить в термо­стат на сутки.

7.2. Изучить посевы на среде Эндо, описать выросшие колонии. Из бесцветных круглых выпуклых прозрачных колоний сделать пересев на среду Олькеницкого штрихом по скошенной поверхности и уколом в глубину столбика. Посевы поместить в термостат на 18–20 часов.

7.3. Изучить посевы на среде Олькеницкого. Для дальнейшего исследования отобрать только те пробирки, в которых среда посинела в столбике (ферментация глюкозы). Пробирки, в которых вся среда посинела (ферментация лактозы или сахарозы) или стала оранжевой (ферментация мочевины) из исследования исключить. Культуры, ферментирующие глюкозу до кислоты и не ферментирующие лактозу и сахарозу, подозрительны на сальмонеллы тифа. Культуры, ферментирующие глюкозу до кислоты и газа и не фер­ментирующие лактозу и сахарозу, подозрительны на паратифозные бак­терии.

7.4. У подозрительных, как патогенные культуры, изучают антигенные свойства в реакции агглютинации с сальмонеллезными сыворотками.

а) для определения родовой принадлежности поставить реакцию агглютинации на стекле с поливалентной сальмонеллезной сывороткой АВСДЕ, содержащей антитела к антигенам наиболее часто встречающих­ся сальмонелл.

Для этого на предметное стекло нанести каплю сыворотки, рядом для контроля – каплю физиологического раствора. В обеих каплях, начиная с контрольной, размешать небольшое количество изучаемой культуры. Если в опытной капле наступает агглютинация, исследова­ние продолжить дальше;

б) определение серогруппы. Определение серогруппы проводят в реакции агглютинации на стекле с монорецепторными сыворотками 0–2, 0–4, 0–6, 0–9, содержащими антитела к групповым О-антигенам. Для постановки реакции на предметное стекло нанести по капле монорецепторных сывороток 0–2, 0–4, 0–6, 0–9 и каплю физиологического раствора для контроля. Во всех каплях размешать петлей небольшое количество изучаемой культуры, прожигая петлю после каждой сыворотки.

Если в одной из капель (отметить в какой) наступит реакция агглютинации, исследования продолжить дальше.

в) определение серовара. Определение серовара проводят по жгутиковому антигену в пер­вой фазе в пределах установленной серогруппы. На предметное стекло нанести каплю монорецепторной Н-сыворотки, для контроля – каплю физиологического раствора. В обеих кап­лях размешать немного культуры и наблюдать реакцию. Если реакция положительна, то по совокупности выявленных антигенов определить вид выделенной культуры по таблице и выдать ответ:

1. Если выделенная культура соответствует сальмонеллам по биологическим и антигенным свойствам, выдать положительный ответ с указанием вида.

2. Если культура не агглютинируется ни видовыми, ни монорецепторными сыворотками, выдать отрицательный результат.

8. Изучение реакции Видаля (по выполненной работе оформить в тетради протокол)

Серодиагностика брюшного тифа может осуществляться через реакцию Видаля. Для постановки реакции Видаля получить сыворотку больного в основном разведении (1:50), из которого приготовить три ряда ра­бочих разведений от 1:100 до 1:800. В рабочие разведения первого ряда внести капли брюшнотифозного диагностикума, в рабочие разведения второго ряда внести по 2 капли паратифозного А диагностикума и в рабочие разведения третьего ряда внести по 2 капли паратифозного В диагностикума (см. схему постановки реакции Видаля, табл.8). Пробирки встряхнуть, поставить на 2 часа в термостат и до суток при комнатной температуре, после чего учесть результат (табл.9).

Результат: если агглютинация положительна, значит, в сыворотке есть антитела, а возбудителем считается тот микроорганизм, диагностикум из которого агглютинируется антителами сыворотки больного.

9. Знакомство с препаратами для специфической диагностики, профилактики и лечения брюшного тифа (записать в тетрадь)

Химическая сорбирования тифо-паратифозно-столбнячная вакцина (ТАВte) содержит выделенные из брюшнотифозной, паратифозных А и В бактерий, антигены и очищенный столбнячный анатоксин, адсорбированные на гидроокиси алюминия. Вакцина применяется для профилактики брюшного тифа, паратифов и столбняка лицам в возрасте от 15 до 50 лет, вводят ее строго подкожно.

Таблица 8

Схема постановки реакции Видаля

№ пробирки Титр Ингредиенты	1	2	3	4	5	1	2	3	4	5	1	2	3	4	5
	1:100	1:200	1:400	1:800	К	1:100	1:200	1:400	1:800	К	1:100	1:200	1:400	1:800	К
1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15	16
Физиологический раствор, мл	1,0	1,0	1,0	1,0	1,01,01	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0
Сыворотка больного, 1:50, мл	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0
Диагностикумы, капли:
Брюшнотифозный	2к	2к	2к	2к в дезр-р	2к
Паратифозный А						2к	2к	2к	2 в дез.р-р	2к
Паратифозный В											2к	2к	2к	2к в дез.р-р	2к

В термостат на 2 часа, до суток при комнатной температуре, после чего учитывают результат

Таблица 9