Основы_Генетики_1А

снижается способность ДНК связываться с белками, участвующими в транскрипции, что приводит к уменьшению генетической активности упакованных в фибриллу 30 нанометров участков.

Рисунок V, 10. Фибрилла толщиной 30 нанометров.

Около 20% всех белков хроматина составляют негистоновые белки. Именно они имеют значение для более высоких уровней компактизации хроматина. Выявляемые на препаратах клеточного ядра шарики диаметром 100 нанометров (хромомеры) имеют петлевую розетковидную структуру (Рисунок V, 11). Это третий уровень компактизации. Он обеспечивает примерно 600-700-кратное укорочение ДНК.

81

Рисунок V, 11. Петлевой домен. А - структура в виде розетки. Б - хромонема.

На препаратах митотических хромосом иногда можно увидеть спираль, образованную нитчатой хроматиновой структурой толщиной около 200 нанометров – хромонемой (Рисунки V, 11 и V, 12). Это четвертый уровень укладки хроматина. Витки хромонемы образуют хроматиду толщиной примерно 500 нанометров, что обеспечивает укорочение ДНК примерно в 104 раз.

82

Рисунок V, 12. Хромонемная организация митотической хромосомы.

5.4 Дифференциальное окрашивание и блочная организация хромосом

При окрашивании митотических хромосом ацидофильными (то есть связывающимися с кислотами) красителями, например эозином, или неспецифическими к нуклеотидам флуоресцентными красителями (флуорохромами – веществами, способными излучать световые волны большей длины при возбуждении светом с меньшей длиной волны) выявляется практически равномерный рисунок без исчерченности. Такая окраска называется рутинной (Рисунок V, 13).

83

Рисунок V, 13. Митотические хромосомы человека, окрашенные рутинно, краситель Романовского-Гимзы – раствор эозина и метиленового синего (по материалам сайта http://131.229.114.77/microscopy/galllm.html).

Если перед окрашиванием митотические хромосомы обработать щелочными растворами, вымывающими ДНК в первую очередь из районов с низкой плотностью хроматина, можно наблюдать интенсивное окрашивание прицентромерных районов всех хромосом и практически полное интенсивное окрашивание Y-хромосомы (Рисунок V, 14). Такой подход называется C-методом дифференциального окрашивания хромосом или C-бендингом. C- положительные (интенсивно окрашенные при использовании этого метода) районы хромосом соответствуют участкам генетически инертного хроматина – или гетерохроматина. Различная степень окрашивания районов хромосом при C-окраске говорит о неоднородности распределения гетерохроматина по длине хромосом.

84

Рисунок V, 14. Митотические хромосомы человека, окрашенные по C-методу. Фотография Е.Г. Нероновой.

В зависимости от степени плотности упаковки фибриллы 30 нанометров различают более конденсированный хроматин – гетерохроматин - и менее конденсированный эухроматин. Гетерохроматиновые участки очень интенсивно окрашиваются при дифференциальной C-окраске хромосом из-за большей плотности и хорошо видны под микроскопом. ДНК, находящаяся в гетерохроматине, не транскрибируется и содержит большое количество повторяющихся последовательностей. На стадии интерфазы гетерохроматин часто располагается по периферии ядра (пристеночный гетерохроматин). В эухроматине ДНК упакована сравнительно неплотно. Гены, находящиеся в эухроматиновых

85

районах, активно транскрибируются. Плотность упаковки хроматина зависит от модификаций гистонов (метилирования, ацетилирования, фосфорилирования), в первую очередь это относится к гистону H1. Гетерохроматин у млекопитающих состоит преимущественно из АТ (аденин-тимин)-обогащенной высокоповторяющейся ДНК. Таким образом, C-окраска позволяет выявлять наиболее различающиеся по своему составу и плотности районы хромосом.

Если обработки перед окрашиванием проводить более мягко, можно обнаружить поперечную исчерченность митотических хромосом. Это дифференциальная G-окраска или G-бендинг (Рисунок V, 15). G-положительные районы соответствуют более компактизованным, менее насыщенным генами участкам хромосом, которые содержат количество АТ-пар большее, чем G-отрицательные районы. Как правило, в G-положительных районах (G+-блоках) находятся тканеспецифические и стадиеспецифические гены, транскрипция которых нужна не во всех клетках. В этом заключается биологическое значение блочной организации хромосом – гены, которые одинаково нужны во всех клетках, находятся в более деконденсированных участках хромосом, где ДНК более доступна для ферментов транскрипции. Для получения отчетливой G-окраски обычно используют мягкую обработку хромосом раствором трипсина с последующим окрашиванием красителем Романовского-Гимзы. По общепринятой трехбуквенной номенклатуре, которая часто используется в записи цитогенетического диагноза, такая окраска обозначается GTG (G-окраска – трипсин – Гимза).

86

Рисунок V, 15. Митотические хромосомы человека, окрашенные по GTG-методу. По материалам сайта http://www.subtelomeres.com/ClinicalDiagnosis_6.html.

G+-блоки также могут быть выявлены при окрашивании хромосом АТ-специфическими флуорохромами (DAPI, Хехст 33258) – это дифференциальная Q-окраска или Q-бендинг (Рисунок V, 16). АТбогатые G-положительные районы связывают большее количество красителя, что приводит к их более интенсивной флуоресценции. Использование этого метода позволяет идентифицировать Y- хромосому даже в интерфазе, поскольку значительная ее часть состоит из необычайно АТ-богатого гетерохроматина, который при связывании с флуорохромами дает бриллиантовое свечение.

87

Рисунок V, 16. Митотические хромосомы человека, окрашенные по

Q-методу. По материалам сайта http://www.translationalmedicine.com/content/3/1/21/figure/F4?highres=y.

Рисунок обратный G-бендингу получается при помощи R- метода дифференциального окрашивания путем тепловой денатурации (Рисунок V, 17). ГЦ-пары, которых больше в G- отрицательных районах хромосом, более устойчивы к этой процедуре. Подавляющее большинство G+-районов соответствует R- и наоборот (Рисунок V, 18). Само название этого метода происходит от английского слова reversed – обратный. R+-районы реплицируются в первой половине фазы S клеточного цикла, а G+-районы - во второй. Существуют методики выявления R-бендинга путем введения в

клетки модифицированных предшественников синтеза ДНК в середине фазы S. Тогда R+-районы не будут содержать модифицированных нуклеотидов, а G+-районы – будут.

88

Рисунок V, 17. Митотические хромосомы человека, окрашенные по

http://www.currentprotocols.com/protocol/hg0402.

89

Рисунок V, 18. Схематическое изображение одной и той же митотической хромосомы, окрашенной при помощи различных методов дифференциального окрашивания. А - C-метод, Б - G-метод, В - R-метод, Г - T-метод.

При более интенсивной тепловой обработке выявляются T- сегменты, расположенные преимущественно в прителомерных районах хромосом (Рисунок V, 19). Их локализация совпадает с наиболее близкими к теломере R-сегментами (Рисунок V, 18). Содержание генов в T+-районах на порядок больше, чем в среднем по длине хромосомы, и больше чем в относительно обогащенных генами R+-районах. Некоторые функциональные особенности позволяют считать T-сегменты наиболее выраженными R-сегментами. В таких районах находится особенно много генов, связанных с наиболее важными функциями жизнеобеспечения клетки – генов домашнего

90