Основы_Генетики_1А

хозяйства – и онкогенов, мутация которых может привести к злокачественной опухоли. Это определяет особое значение теломерных районов в онкогенезе.

Рисунок V, 19. Митотические хромосомы человека, окрашенные по T-методу – флуоресцентный вариант гибридизации с использованием Alu-специфических ДНК-зондов (глава VIII). По материалам сайта http://www.statemaster.com/encyclopedia/Image:PLoSBiol3.5.Fig7Chrom osomesAluFish.jpg

Районы ядрышковых организаторов (ЯОР), содержащих гены рибосомной РНК и формирующих в интерфазе ядрышки, могут быть выявлены при помощи окраски нитратом серебра (AgNO3). Такой тип окраски называется N-бэндинг.

Для обозначения хромосомы человека используется аббревиатура HSA (от латинского видового названия Homo sapiens) и цифра, соответствующая номеру хромосомы. Например, HSA21 – хромосома 21 человека. В клинической практике обозначение HSA иногда опускают, поскольку ясно, что речь идет о человеке. Для удобства определения отдельных районов хромосом их обозначают числами как показано на рисунке V, 20. Последняя цифра числового

91

обозначения указывает на определенный бэнд – полоску, выявляемую при дифференциальном окрашивании, первая цифра указывает на условную часть хромосомы, состоящую из нескольких бэндов. По умолчанию приводят обозначения сегментов, выявляемых G-методом. Теломеры обозначаются ter. Длинное и короткое плечи обозначаются q и p, соответственно.

Примеры:

HSA14p11 – район 11 короткого плеча хромосомы 14 человека

HSAXqter – теломер длинного плеча Х-хромосомы человека

5pter-p11 – участок, ограниченный теломером и бендом 11 короткого плеча хромосомы 5 (включает 5p11, 5p12, 5p13, 5p14, 5p15.1, 5p15.2 и 5p15.3) (Рисунок V, 20).

92

Рисунок V, 20. Схема обозначения районов хромосом на примере хромосомы 5 человека (HSA5), дифференциально окрашенной по G- методу (уровень разрешения 400 сегментов на кариотип).

Для повышения точности цитогенетического анализа часто используют прометафазные и даже профазные хромосомы, что позволяет увеличить число распознаваемых сегментов дифференциального окрашивания до 850 и 1700, соответственно.

93

5.5 Гибридизация in situ, хромосомный пейнтинг и сравнительная

геномная гибридизация (CGH)

ДНК имеет двунитевую структуру. Это дает возможность провести плавление (денатурацию), то есть перевести ДНК в однонитевую форму, затем восстановить двунитевую структуру по принципу комплиментарности с использованием однонитевой молекулы ДНК-зонда - иными словами провести гибридизацию двух молекул ДНК. Если молекула ДНК-зонда содержит меченые нуклеотиды, ее можно выявить при помощи одной из систем детекции гибридизационного сигнала. Гибридизация нуклеиновых кислот in situ (от лат. in situ – на месте) подразумевает проведение процедуры непосредственно на цитологическом препарате хромосом, интерфазных ядер или цитоплазмы.

Изначально метод гибридизации in situ применялся только для локализации повторяющихся последовательностей, сгруппированных в одном или нескольких районах митотических хромосом, благодаря чему они образуют относительно крупный участок связывания (мишень) для молекул зонда.

В 80-е годы XX столетия стали появляться сообщения о применении метода гибридизации in situ для локализации уникальных последовательностей на митотических хромосомах с использованием статистического анализа.

Выявление уникальных последовательностей ДНК в митотических хромосомах требует соблюдения трех условий. Вопервых, зонды должны быть надежными: четко охарактеризованными и чистыми. Во-вторых, необходимы специальные приемы,

94

облегчающие связывание молекул зонда и мишени в хромосомах. В- третьих, неспецифическое связывание ДНК-зонда с цитологическим материалом должно быть сведено к абсолютному минимуму. Выполнение первого условия в настоящее время практически не вызывает затруднений, поскольку для получения ДНК-зондов можно использовать технологию генной инженерии. Второе условие также выполнимо благодаря использованию декстран сульфата - агента, эффективно повышающего (примерно в 10 раз) скорость ренатурации одноцепочечных молекул ДНК в растворе. Это способствует образованию протяженных сотовидных конгломератов одноцепочечных молекул ДНК, связанных между собой за счет случайно расположенных двухцепочечных участков.

Использование в качестве метки радиоактивных изотопов позволяет эффективно локализовать даже небольшие фрагменты ДНК

– порядка 1-2 т.п.н. Основными недостатками изотопного варианта гибридизации являются относительно низкая разрешающая способность, необходимость длительной процедуры авторадиографии и технические и сложности, связанные с хранением и использованием радиоактивных веществ.

Негативные аспекты использования радиоактивной метки служили стимулом для попыток разработать эквивалентные по эффективности, но более безопасные, быстрые и дешевые методы. В результате были разработаны методы гибридизации с использованием нерадиоактивно меченых зондов, выявляемых посредством различных иммунохимических методов. Было установлено, что новая технология гибридизации обладает рядом преимуществ, к которым относится ее полная безопасность для исследователя. Другим положительным

95

свойством нерадиоактивно меченых зондов является их химическая устойчивость в течение нескольких месяцев. Применение нерадиоактивных меток обеспечивает более высокую разрешающую способность, чем работа с изотопами, а в ряде случаев повышает уровень информативности. Неизотопная гибридизация позволяет картировать (то есть определять местоположение на хромосоме) уникальные гены размером около 1 т.п.н. Наконец, результаты гибридизации можно анализировать сразу после проведения эксперимента. Таким образом, преимущества нерадиоактивного мечения зондов заключаются в высокой разрешающей способности, точности, воспроизводимости, дешевизне и безопасности.

Чувствительность данного метода зависит от размера гена, количества его копий, специфической активности зонда, а также от количества молекул флуорохрома, присутствующих в гибриде на заключительной стадии эксперимента.

Неизотопный вариант гибридизации in situ позволяет использовать несколько ДНК-зондов, меченных разными агентами, на одном цитологическом препарате (многоцветная гибридизация). Такой подход используют для тонкого интерфазного картирования с разрешающей способностью до 100 т.п.н.

Повышению специфичности метода служит супрессия (подавление) неспецифической гибридизации путем добавления в гибридизационную смесь небольшого количества конкурирующей ДНК. Такая процедура необходима при использовании в качестве зондов больших геномных последовательностей ДНК.

96

В настоящее время наиболее часто используется метод биотинового мечения. Его принцип основан на сильном взаимодействии биотина с белком авидином вследствие их высокого сродства. Молекула авидина потенциально может образовать 4 химические связи, поэтому после связывания его с биотином три связи остаются свободными, что используется при детекции сигнала гибридизации.

Приготовление хромосомных препаратов производится согласно существующим методикам. На следующем этапе метафазные хромосомы подвергаются обработке РНК-азой с целью удаления связанной РНК. Далее ДНК зондов и хромосом денатурируют, создавая одноцепочечные структуры. Хромосомные препараты инкубируют с зондом в течение определенного времени. Затем удаляют избыток меченой ДНК, не связавшейся с денатурированной ДНК хромосом, посредством специальной отмывки препаратов. Последним этапом эксперимента является детекция сайтов гибридизации. Суть его сводится к следующему: ДНК, содержащая в своем составе биотин, легко распознаваема при контакте ее с авидином (стрептавидином). Последний, в свою очередь, может быть выявлен флуоресцентно. Такой подход в наше время является наиболее распространенным и называется флуоресцентная гибридизация in situ (FISH – fluorescent in situ hybridization) (Рисунок

V, 21).

97

Рисунок V, 21. Двуцветный вариант флуоресцентной гибридизации in situ. По материалам сайта http://qwickstep.comsearchchromosome12.html.

В последние годы для картирования геномов высших эукариотов используют протяженные ДНК-зонды величиной 10 - 150 т.п.н., которые, как правило, клонируют в космидах (см. глава VI) или в искусственных хромосомах дрожжей или бактерий. Применение перекрывающихся протяженных ДНК-клонов (контигов) позволяет связать хромосомный и молекулярный уровни картирования геномов.

Для выявления тонких хромосомных перестроек и для быстрой идентификации хромосом применяют метод хромосомного пэйнтинга - в этом случае в качестве зонда для гибридизации используют последовательности из хромосомоспецифических библиотек.

хромосомоспецифических зондов и получить изображение, где каждая хромосома представлена своим цветом (Рисунок V, 22). Присутствие фрагментов другого цвета на хромосоме будет говорить о хромосомной перестройке.

Рисунок V, 22. Хромосомный пейнтинг (мультиFISH или спектральный анализ кариотипа). По материалам сайта http://people.musc.edu~hazardsWebBioInformaticsSKY_CGH.htm.

В последние годы для выявления тонких хромосомных перестроек, размер которых может лежать за пределом разрешающей способности микроскопа, используют метод сравнительной геномной гибридизации (CGH – comparative genomic hybridization). Суть метода заключается в количественной оценке ДНК, связывающейся с молекулой короткого зонда на биочипе (Рисунок V, 23). Все хромосомы и отдельные районы представлены специфическими только для них ДНК-зондами, закрепленными на стекле. Координаты

99

каждой такой последовательности введены в специальную программу. ДНК от анализируемого индивидуума и контрольный образец метят разными флуорохромами и гибридизуют на биочипе. После отмывок сканер считывает уровень флуоресценции в отдельных точках на биочипе. Этот уровень прямо пропорционален количеству связавшейся ДНК с определенным зондом, локализация которого известна. Снижение вдвое уровня флуоресценции в местах расположения зондов из определенного района по сравнению с нормальной клеткой свидетельствует о гетерозиготности по делеции (утрате) данного района. У гомозигот по делеции флуоресценция зондов из делетированных районов отсутствует вовсе. У гетерозигот по дупликации (удвоению хромосомного района) флуоресценция зондов из дуплицированного района в полтора раза выше, чем у кариотипически нормальных индивидуумов.

100