13. Меристематическая культура.

Для получения меристематической культуры используют меристему – образовательную ткань растений, долго сохраняющую способность к делению и образованию новых клеток, и отличающуюся высокой метаболической активностью. Для культивирования изолируют конусы нарастания побегов, корней, а также пазушные почки. Меристематические культуры более известны в садоводстве, т.к. они дают возможность получить безвирусные клоны. Из этого можно сделать вывод о том, что распределение вирусов в различных частях растения неравномерно, а меристема их вовсе лишена. Из безвирусной меристемы в большом количестве можно регенерировать генетически идентичные безвирусные растения. Этот способ используют для выведения новых сортов картофеля, винограда, а также декоративных растений, в лесоводстве.

14. Культура пыльников.

Культура пыльников используется для получения гаплоидных растений, как правило, растение используется диплоидным, т.е. в его клетках содержаться два гомологичных набора хромосом. Только зародышевые клетки являются гаплоидными. Для получения гаплоидной культуры наиболее удобны незрелые пыльники, в которых пыльцевые зерна находятся еще на стадии, предшествующей первому делению микроспор на вегетативные и генеративные зерна. После переноса стерильных пыльников на питательную среду пыльцевые клетки начинают делиться, при этом развивается, или промежуточный каллус или сразу образуется гаплоидный зародыш, который позднее дифференцируется в гаплоидное растение. Такие гаплоидные растения стерильны, но они могут перейти в диплоид после воздействия колхицина или слияния протопластов. Таким образом образуются плодовитые гомозиготные чистые линии растений, имеющие большое значение для селекции, поскольку в последующих поколениях всегда встречаются те же заданные признаки. Благодаря этому методу выведены новые сорта зерновых и табака, а также получены многочисленные лекарственные растения с улучшенными свойствами.

15. Иммобилизованные клетки.

Каллусные культуры при поверхностном культивировании накапливают вторичные метаболиты в большем количестве, чем клетки, растущие в жидкой среде. Показано, что у многих видов растений компактные, медленно растущие каллусные ткани на агаризованной среде накапливают алкалоидов больше, чем рыхлые и быстро растущие культуры, т.е. для нормального метаболизма необходима какая-то пространственная организация клеток. Положение клетки внутри организма является одним из факторов, определяющим степень и тип ее дифференциации. Клетки растущие изолированно друг от друга и в виде агрегатов, имеют совершенно различные условия окружения, и как следствие этого, различные пути метаболизма. Можно предположить, что чем ближе клетка или группа клеток по уровню организации к целому растению, тем более вероятно, что в них будут реализовываться метаболические пути, характерные для целого организма. Имеющиеся в литературе данные очищенной положительной корреляции между накоплением вторичных метаболитов и степенью дифференцировки в культурах клеток подтверждают это. В связи с этим в последнее время усилился интерес к иммобилизованным клеткам.

Иммобилизация клеток обеспечивает условия, приводящие к дифференциации и способствует увеличению выхода вторичных метаболитов. Иммобилизация позволяет клеткам расти в тесном физическом контакте друг с другом. При взаимном контакте клеток, в их массе, как в организме устанавливаются определенные химические и физические градиенты, регулирующие метаболизм и процессы дифференциации (градиенты регуляторов роста, питательных веществ, кислорода и углекислоты).

Растительные клетки могут быть иммобилизованы 4 способами:

1. иммобилизация в инертном субстрате, т.е. обволакивание клеток одной из различных цементирующих сред с альгинатом, агаром, полиакриламидом, коллагеном или комбинацией гелей;

2. адсорбция клеток на инертном субстрате;

3. ковалентное связывание клеток с каким-либо инертным субстратом;

4. адсорбция клеток на инертный субстрат с помощью биологических молекул (лектины).

На практике чаще всего применяют первые два способа. Клетки прикрепленные к биологическому инертному субстрату, дольше сохраняют жизнеспособность. Вокруг иммобилизованных клеток могут циркулировать большие объемы питательной среды, регулируя состав которой, замедляют рост клеток и тем самым повышают выход вторичных продуктов.

Иммобилизованные клетки необходимо снабжать в большом количестве предшественниками, но в низких концентрациях. Предшественники должны быть как можно ближе к искомому продукту в цепи биосинтезов. Поскольку клетки в иммобилизованном состоянии культивируются длительное время, то для этого используются клетки, которые сами, естественным путем секретируют необходимые метаболиты в питательную среду или могут быть принуждены к такой секреции какими-либо приемами, например воздействием низких температур и растворителей. Клетки, которые накапливают искомый продукт внутри, например в вакуолях или пластидах, непригодны для иммобилизации. Извлечение продукта из омывающего клетки раствора – тоже весьма нелегкая проблема с точки зрения экономичности производства.

Если иммобилизованные клетки предназначаются для промышленного использования, важную роль играет выбор типа биореактора. Более удобной будет колоночная культура, поскольку при этом экономится пространство и облегчается контроль за током питательных веществ через клетки, в случае надобности улучшается освещенность культуры. Клетки некоторых видов растений, как было отмечено выше, для обеспечения уровня метаболизма, близкого к происходящему в клетках интактного растения, требуют света.

Иммобилизованные клетки могут быть использованы не только для синтеза, но идля биотрансформации различных соединений. Их преимущество состоит в том, что благодаря увеличелагодаря увеличеонирования клеток в иммобилизованном состоянии удешевляется процесс биокатализа. А. Альферманн с сотрудниками провели опыт: они культивировали клетки наперстянки шерстистой (Digitalislanata), окутанные альгинатным гелем (50 шариков диаметром 4 – 5 мм), в 100-миллилитровых колбах Эрленмейера в 25 мл среды. Среду с субстратом меняли каждые три дня. В качестве субстрата добавлялся-метилдигитоксин, который трансформировался клетками в-метилдигоксин. В таких случаях культивирования клетки осуществляли биотрансформацию субстрата в продукт с постоянной скоростью в течение 170 суток. Сердечный гликозид дигоксин обладает большим терапевтическим эффектом по сравнению дигитоксином, которого в растениях содержится значительно больше. Дигоксин отличается от дигитоксина лишь по дополнительной гидроксильной группе на двенадцатом атоме углерода. Недифференцированные культуры клеток наперстянки шерстистой не образуют сердечных гликозидов, но могут осуществлять определенную реакцию трансформации субстратов, добавленных в питательную среду.

Преимущества иммобилизованных растительных клеток в сравнении с суспензионными культурами:

1. многократное использование биомассы путем сохранения клеток в биореакторе и выделения продукта из среды;

2. физическое отделение клеток от среды;

3. культивирование большого количества биомассы в сосудах небольшого объема;

4. длительность культивирования;

5. возможность эффективной биотрансфомации.

Задание 2. Определение активности супероксиддисмутазы (СОД) из культивируемых растительных клеток.

Целью данной работы является освоение колориметрического метода определения СОД.

Одним из побочных продуктов окислительно-восстановительных реакций, отсутствующим только у облигатных анаэробов, является супероксидный радикал О₂^-. Против токсичности О₂^-клетки имеют свои средства защиты, а именно – фермент СОД, переводящий супероксидные радикалы в менее токсичную перекись по схеме:

СОД

4Н⁺+ 2 О₂^-2 Н₂О₂.

Образующаяся перекись водорода далее, под действием каталазы в животных и пероксидазы в растительных тканях, переводится в безопасную для организма форму:

каталаза

2Н₂О₂2 Н₂О + О₂.

Дианизидиновый метод определения активности СОД основан на том, что под действием ультрафиолетового света рибофлавин (Rb) переходит в вожбужденное состояние (Rb^*) и способен атаковать восстановленный дианизидин (ДН₂) с образованием радикалов дианизидина (ДН^.) и флавин семихинона (RbН). Образующийся флавин семихинон далее восстанавливает молекулярный кислород с образованием супероксидного радикала (О₂^-). При отсутствии СОД супероксидный радикал восстанавливает радикал дианизидина:

Н⁺+ О₂^-+ ДН^.ДН₂+ О_2.

В присутствии СОД концентрация О₂^-очень мала, поэтому радикалы дианизидина взаимодействуют между собой, давая молекулу восстановленного (неокрашенного) и одну окисленного (окрашенного) дианизидина:

2ДН^.ДН₂+ Д (окрашенный).

Чем выше активность СОД, тем больше образуется окисленной формы дианизидина, имеющей максимум поглощения при 460 нм. Величина экстинции Е₄₆₀, умноженная на переводной коэффициент 100, выражает активность СОД в единицах Фридовича, названных так в честь исследователя, открывшего и охарактеризовавшего фермент.

Техника выполнения работы. Навеску 2,0 г ткани тщательно растирают в ступке с пестиком с 2 мл буфера для гомогенизации. Гомогенат переносят в центрифужную пробирку и центрифугируют 10 мин при 6000 об/мин. Супернатан (надосадочная жидкость) фильтруют через складчатый фильтр. В фильтрате определяют активность СОД.

Для этого сначала готовят четыре пробирки с фосфатным буфером, имеющим различные значения рН.

№ пробирки	Na2HPO4, мл	NaH2PO4, мл	рН
1	0,11	1,29	5,8
2	0,69	0,71	6,8
3	1,28	0,12	7,8
3	1,4	------	8,4

В каждую пробирку вносят по 1,2 мл буфера, 40 мкл о-дианизидина, 0,25 мл рибофлавина и 0,2 мл исследуемой пробы, тщательно перемешивают и оставляют на 4 мин. Параллельно ставят контроль, для чего к 1,4 мл воды добавляют 40 мло-дианизидина и 0,25 мл рибофлавина. По истечении указанного времени пробы облучают в течение 10 мин под ультрафиолетовой лампой с расстояния 10 см, охлаждают при комнатной температуре, измеряют оптическую плотность при 640 нм и вычисляют активность СОД по формуле:

А = Е₄₆₀*100 Ед. Сод.

Строят график зависимости активности фермента от рН среды, делают выводы.

Практическая значимость работы.Комплексные препараты СОД, выделенные из культур растительных тканей, могут быть использованы для лечения различных воспалительных заболеваний, в качестве радиопротекторных средств, кардиологии и для других целей.

Литература:

1. Биологическая химия: Руководство к лабораторным занятиям/ Сост. Комов В.П., Шведова В.Н., Кириллова Н.В., Спасенкова О.М., Фирсова В.И., Троицкая Л.А. – СПб.: СПХФА. – 1998.

2. Биотехнология в 8-ми томах/ Под ред. Егорова Н.С., Самуилова В.Д. – М.: Высш.шк. – 1988.

3. Биотехнология: принципы и применения/ Под ред. Хиггинса И., Беста Д., Джонса Дж. – М.: Мир. – 1988.

4. Биотехнология: состояние и перспективы развития: Материалы 1-ого Международного конгресса (Москва, 14 – 18 окт. 2002 г.). – М.: ЗАО «ПИК Максима», РХТУ им. Д.И. Менделеева. – 2002. – 544 с.

5. Валиханова Г.Ж. Культура клеток растений как объект биотехнологии: Курс лекций. – Казахстан: Казахский Национальный Университет имени аль-Фараби. – 2002.

6. Елинов Н.П. Основы биотехнологии. СПб.: ИФ Наук. – 1995.

7. Лекционный материал по биотехнологии.

8. Николаева Л.А. Культура тканей лекарственных растений и ее биотехнологическое использование: Текст лекций. – СПб.: СПХФИ. – 1992.

8. Сассон А. Биотехнология: свершения и надежды/ Пер. с англ. Мехедова С.Л., Миркина С.М. – М.: Мир. – 1987.

9. Сельскохозяйственная биотехнология: Учеб./ Под ред. В.С. Шевелухи. – М.: Высш. шк. – 1988. – 416 с.

10. Словарь по биотехнологии/ Симонян А.В., Покровская Ю.С. – Волгоград. – 2002.

11. Чуешов В.И. Промышленная технология лекарств: Учебник в 2-х т./ Под ред. Чуешова В.И. – Харьков: МТК - Книга; Издательства НФАУ. – 2002. – 716 с.

Темы рефератов.

1. Разработка методов культивирования растительных тканей и изолированных клеток как достижение биотехнологической науки.

2. Перспективы иммобилизации растительных клеток.

3. Проблемы экскреции целевого продукта из иммобилизованных клеток.

4. Методы контроля и идентификации биомассы и препаратов, полученных методами клеточной биотехнологии.