Занятие 9.

ТЕМА ЗАНЯТИЯ:Технология культивирования растительных клеток. Каллусные и суспензионные культуры. Методы получения и контроля культур.

ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ:Рассмотреть теоретические основы культивирования растительных клеток и тканей. Ознакомиться с особенностями получения каллусных и суспензионных культур.

Вопросы, выносимые на семинар:

1. Охарактеризуйте понятие «культура растительных тканей».

2. Перечислите преимущества использования растительных клеток в биотехнологии.

3. Охарактеризуйте направления развития клеточной биотехнологии.

4. Поясните значение свойства тотипотентности клеток для их практического использования.

5. Охарактеризуйте этапы технологической схемы получения культуры растительных клеток.

6. Введите понятие «эксплант». Укажите основные этапы подготовки экспланта для культивирования.

7. Охарактеризуйте особенности технологии приготовления питательных сред для культивирования изолированных клеток и тканей. Рассмотрите роль ингредиентов, входящих в состав питательной среды, для получения культуры растительных клеток.

8. Охарактеризуйте условия, которые необходимо соблюдать при культивировании изолированных клеток и тканей растений.

9. Введите понятия «каллусная культура» и «каллус». Приведите характеристику культуры каллусных тканей. Рассмотрите этапы формирования каллусной культуры. Поясните особенности кривой роста каллусной культуры.

10. Рассмотрите свойства каллусных клеток: общие с нормальными клетками и свойства, характерные только для каллусных клеток.

11. Охарактеризуйте особенности генетики каллусных клеток. Перечислите причины генетической нестабильности культивируемых растительных клеток.

12. Охарактеризуйте особенности клеточных суспензий. Рассмотрите технику получения клеточных суспензий. Укажите роль клеточных суспензий в практическом аспекте. Перечислите и поясните основные характеристики клеточных суспензий.

13. Введите понятие культуры одиночных клеток. Введите понятие «клон». Поясните трудности культивирования одиночных клеток и методы их устранения.

14. Дайте определение понятий «протопласт», «культура протопластов». Поясните особенности технологии получения протопластов. Приведите примеры.

15. Охарактеризуйте особенности меристематической культуры.

16. Введите понятие «культура пыльников». Охарактеризуйте ее практическое значение.

Задание 1:Изучить учебный материал.

Учебный материал.

Растения издавна являются поставщиками соединений для различных отраслей химической промышленности. Это не только сахар, но и целый ряд сложных вторичных метаболитов, к которым относятся каучук, а также вещества, используемые в качестве красителей, вкусовых добавок и пряностей. Получить эти вещества с применением технологии химического синтеза очень сложно, а подчас и просто невозможно из-за сложности их строения. Поэтому в настоящее время, воодушевленные последними успехами, ученые вновь и вновь обращаются к царству растений. Они не только пытаются отыскать пути к улучшению способов выработки уже освоенной продукции, но и разработать новые принципы биотрансформации и выделить, таким образом, новые продукты.

Важнейшей целью в ближайшие годы является необходимость заставить гены растений «работать» в бактериальных клетках; сложность этой задачи заключается в том, что мы плохо знаем, даже как они «работают» в собственных клетках.

Кроме того, вторичные метаболитыобразуются в результате сложных многоступенчатых процессов, о механизмах, регуляции которых почти ничего не известно.

Таким образом, путем использования культур растительных клеток и тканей возможна разработка новых подходов к получению ценных химических продуктов, особенно лекарственных веществ, а также по улучшению сортов растений, кроме того, появляется возможность контролировать образование данных веществ и при этом независимо от условий природы, вредителей растений, оказывающих влияние на образование нужных нам веществ.

1. Понятие культуры растительных тканей.

Под культурой тканей растения принято понимать способность растительных клеток размножаться на искусственных питательных средах. Получают такие культуры путем выращивания в длительной пересадочной культуре тканей растения в виде недифференцированных каллусной массы в стерильных условиях.

В настоящее время термин «культура клеток растений» превратился в широкое удобное понятие, охватывающее все виды работы invitroс культурами изолированных клеток (а также части клеток - протопластов), тканей, органов, зародышей и целых растений-регенератов. Терминinvitro(лат. – «на живом») применяют по отношению к естественным нестерильным условиям протекания процесса жизнедеятельности в организме. Термин растение-регенерат означает асептически полученное растение с развитыми корнями и побегами, сформировавшееся в культуре, т.е.invitro.

В природе каллусообразованиевстречается в основном как ответная реакция на повреждение растения, когда на месте раны образуется нарост, а вкультуре тканивсе растительные клетки превращаются в каллусные.Каллусы растенийлегко образуются на эксплантах изразличных органов растений: отрезках стебля, корня, проростках семян, фрагментах паренхимы ткани клубня, органах цветка, плодов, зародышей и т.п. При помещении эксплантов на питательную среду паренхимальные клеткидедифференцируются, переходят к делению, образуя однородную недифференцированную биомассу, получившую названиекаллуса. В асептических условиях каллус отделяют и помещают на поверхность агаризованной питательной среды для дальнейшего роста. В результате получаюткультуру каллусной ткани, которую можно поддерживать неограниченно долго, периодически разделяя ее натрансплантаты и пересаживая их на свежую питательную среду.

Одной из важнейших особенностей культуры тканей растения является сохранение способности к синтезу вторичных метаболитов, свойственных данному виду – алкалоидов, гликозидов, эфирных масел, стероидов и др. Данная особенность определяет практическую ценность культуры тканей растений в области выращивания биомассы клеток как принципиально нового вида лекарственного сырья.

Таким образом, в настоящее время технологии, основанные на культивировании тканей высших растений для получения редких и дорогостоящих веществ, включены в биотехнологические программы, разрабатываемые в России и во многих странах мира. Использование технологий, основанных на промышленном выращивании культур тканей продуцентов в качестве лекарственного сырья, имеет ряд преимуществ перед традиционными способами получения сырья. Но, использование такого сырья в фармации экономически выгодно только для продуктов, рыночная стоимость которых достаточно велика на международном рынке.

Культуры тканей растений в настоящее время выращивают в основном двумя способами:

а) на твердых агаризованных питательных средах или различных гелеобразующих подложках;

б) в жидких питательных средах.

В жидкой питательной среде каллус легко распадается на отдельные агрегаты клеток, давая тем самым начало суспензионной культуре.

Известны два способа культивирования растительных тканей в жидкой питательной среде:

а) накопительное;

б) непрерывное.

Важный фактор создания эффективной биотехнологической системы –правильный подбор питательной среды, обеспечивающей потребности культуры ткани продуцента в химических компонентах, необходимых для обеспечения оптимального биосинтеза целевого продукта. Обязательными компонентами питательных сред служатсмеси минеральных солей(макро- и микроэлементов),фитогормоны, выступающие как факторы регуляции процессов клеточного деления и дифференциации, и, т.к.питание культур тканей гетеротрофно,источник углерода вводится в состав среды в виде сахарозы. Получение автотрофных культур тканей – задача будущего.

При приготовлении плотных питательных сред в качестве подложки используют агар-агар, образующий с водой гель или другие гелеобразующие вещества: силикагели, биогели, полиакриламидные гели, пенополиуретаны и др.

Культура тканей растения служит источником значительной генетической изменчивости, которую называют сомаклональной.Благодаря этой особенности культуру ткани стали интенсивно использовать в генетико-селекционных исследованиях для улучшения свойств растений. Сомаклональная изменчивость представляет основу для получения клеточных линий и штаммов с высокой биосинтетической способностью. Для увеличения спектра изменчивости используют мутагенез и селекцию на клеточном уровне наиболее продуктивных клеточных линий. Таким образом, получение мутантных клеточных линий в самом ближайшем будущем будет дополнено методами создания продуктивных штаммов путем гибридизации соматических клеток и генетической инженерии.

Культуры растительных тканей можно получить из любого вида растений, используя разнообразные питательные среды. Познание особенностей физиологии и биохимии этих культур позволили значительно повысить их урожайность и выход биомассы.

Перспективы развития биотехнологии на основе культур растительных тканей представляются весьма многообещающими. Предполагается наладить производство новых лекарственных препаратов, подсластителей, средств защиты растений, веществ для косметической и парфюмерной промышленности.

2. Историческая справка и общая характеристика роли клеточной инженерии в развитии биотехнологии.

1. Свойства растений, используемые в биотехнологии.

Благодаря новейшим открытиям молекулярной биологии и генетики, достижениям генной инженерии, растения стали быстро вовлекать в сферу биотехнологии. Этому способствует ряд особенностей жизнедеятельности и размножения растений – способность к неограниченному вегетативному размножению,т.е. к регенерации полноценного растения из черенка, а в условиях биотехнологических систем – из небольшой группы клеток и даже из одной клетки. При культивировании в питательных средах растительные клетки способны в одних условиях неограниченно размножаться,быстро наращивать биомассу, а в других –дифференцироваться, образовывать корешки, стебельки, листочки (формируя в пробирке миниатюрное растеньице), а затем переходить к цветению и плодоношению.Таким образом, весь свой биологический цикл растения могутосуществлять в неполовых контролируемых условиях биотехнологических систем.Оказывая на развивающиеся в этих условиях растения физические, химические и другие воздействия, можно направленно улучшать культивируемые сорта, повышать их продуктивность, использовать растительные клетки в качестве продуцентов БАВ.

2. Историческая справка.

Метод культуры растительных тканей возник как экспериментальная биологическая модель, позволяющая изучать физиологические, биохимические и другие процессы на уровне автономных клеток, освобожденных от регулирующего влияния целого растительного организма. История этого метода начинается с опытов Габерландта (1902 г), впервые высказавшего идею о возможности выращивания изолированных из организма клеток. Он работал с отдельными клетками палисадной паренхимы листа ряда покрытосеменных растений и использовал в качестве питательной среды раствор Кнопа с добавлением сахарозы, аспарагина и пептона. Г. Габерландт выдвинул гипотезуочищенной тотипотентности любой живой клетки растения и пытался вырастить ткань из единственной клетки. Однако ему самому не удалось экспериментально доказать свою гениальную догадку, т.к. он выбрал неудачные объекты: узкодифференцированные специализированные клетки, утратившие способность к активному делению и эмбриональному росту. Как позже стало известно, успешно могут культивироваться меристематические и активно функционирующие клетки молодых тканей.

Первыми лекарственными растениями, исследованными в культуре ткани, были барвинок розовый и белена черная, причем опытами Телле иГотре была доказана способность культуры ткани белены к синтезу алкалоидов.

Работы Ф. Уайта с кончиками корней томата и Р. Готре с камбиальными тканями ивы и моркови в 30-е гг. легли в основу современных методов культуры тканей. Ф. Уайт поддерживал непрерывную длительную культуру кончиков корней около 30 лет, еще дольше культивировались каллусные клоны, полученные Р. Готре из камбия и флоэмы корня моркови. Он ввел в питательную среду ауксин и показал его способность стимулировать деление клеток камбия. Ф. Уайт и Р. Готре внесли неоценимый вклад в становление современного метода культуры тканей растений, и с этого времени начинается интенсивное развитие этого нового направления экспериментальной биологии растений.

В конце 50-х гг. появились работы по выращиванию растительных тканей в жидкой питательной среде в виде суспензионной культуры, что позволило перейти от пробирок и колб к получению биомассы в ферментерах. В это время наметились возможные области применения клеточных культур в промышленности.

В 70-х гг. спектр соединений, получаемых с помощью культур тканей в количествах характерных для целого растения, был ограничен. Экспериментальные данные указали, что биосинтез многих соединений в недифференцированных тканях сильно репрессирован, а появление продуктов во многих случаях было связано как раз с процессом дифференцировки тканей (регенерация корней, побегов и т.п.). К этому времени была установлена способность некоторых культур к образованию соединений, не обнаруженных в исходных растениях, что позволило рассматривать их как продуцент принципиально иных, нетрадиционных БАВ, т.е. стал возможным направленный синтез природных соединений в культуре ткани путем введения в состав питательной среды простых доступных соединений для их биотрансформации ферментной системой культуры ткани в фармакологически ценные продукты (например, биотрансформации карденолида дигитоксина в дорогостоящий дефицитный дигоксин).

В 80-е гг. на базе метода культуры ткани возникли новые направления биотехнологии, важнейшим из которых стала клеточная биотехнология (инженерия); т.е. способность клеток в культуре тканей при изменении условий культивирования давать начало целому организму – растению (явление тотипотентности) привела к созданию промышленных клеточных технологий микроклонального размножениярастений, позволяющих в короткие сроки размножать ценные растения.

В бывшем СССР исследования в области культуры тканей были начаты в 1944 г. в Институте физиологии растений в Москве под руководством Н.А. Максимова и А.А. Прокофьева и далее успешно продолжены Р.Г. Бутенко, создавшей советскую школу биотехнологии растений.

Сформировались научные центры, внесшие существенный вклад в развитие современных представлений очищенной биологии клеток в культуре (Киев – Ю. Глеба, А. Смирнов, Б. Левенко и др., Иркутск – К. Гамбург и др., Алма-Ата – М. Айтхожин, Р. Рахимбаев и др.).

Таким образом, метод культуры клеток, тканей и органов является в настоящее время общепризнанным и широко применяется во всем мире для решения фундаментальных и прикладных вопросов биологии растений. Исследования и разработки в биологии в последние лет 20 привели к формированию и развитию самостоятельной отрасли знаний клеточной биотехнологии.

3. Значение клеточной инженерии.

Благодаря биотехнологии традиционные методы гибридизации растений, приведшие к «зеленой революции», т.е. кардинальному повышению урожайности, расширились и стали проводиться на клеточном уровне.

С помощью новых методов клеточной инженерии теперь сливают друг с другом клетки разных растений и получают на их основе новые гибридные растения. Новые методы чрезвычайно расширили границы спектра скрещиваемых растений, куда вошли нескрещивающиеся в природных условиях виды. Однако техническая возможность соединения клеток очень отдаленных видов растений не всегда означает преодоление их биологической несовместимости, поэтому не все гибриды могут сохраняться.

Таким образом, клеточная биотехнологиябазируется на использовании культур клеток, тканей и протопластов. Для того чтобы манипулировать клетками, необходимо выделить их из растения и создать такие условия, при которых они могли бы жить и размножаться вне растительного организма. Метод культивирования изолированных клеток и тканей на искусственных питательных средах в стерильных условиях (invitro) получил названиекультуры изолированных тканейи приобрел особое значение в связи с возможностью его использования в биотехнологии.

По сравнению с традиционным растительным сырьем клеточные культуры обладают следующими преимуществами:

• независимость от влияния различных факторов окружающей среды (климат, сезон, погода, почвенные условия, вредители);

• более высокий выход и качество продукта благодаря оптимизации и стандартизации условий выращивания;

• экономия посевных площадей;

• растения – источник многих экономически важных веществ, но запасы растительного сырья в природе постепенно истощаются, следовательно, нетрудно представить место клеточной технологии в будущем.

4. Основные направления развития клеточной инженерии.

Выделяют три основные направления развития клеточной инженерии:

Первое направлениесвязаносо способностью изолированных растительных клеток, продуцировать ценныедля медицины, парфюмерии, косметики и других отраслей промышленностивторичные метаболиты:алкалоиды, стероиды, гликозиды, гормоны, эфирные масла и др. Такие соединения получают из каллусной ткани, выращенной на твердой или жидкой питательной среде. С применением клеточных технологий получают такие медицинские препараты, как диосгенин из клеток диоскореи, аймолин из клеток раувольфии змеиной, тонизирующие вещества из клеток женьшеня, используемые в медицине и парфюмерии. Продуктивность культивируемых клеток в результате клеточной селекции может значительно повысить продуктивность целых растений. Преимуществом данного способа получения вторичных метаболитов является возможность использования для этой цели растения, не произрастающие в наших природных условиях и получать продукцию круглый год.

Второе направлениесвязанос использованием культуры изолированных тканейдля размножения и оздоровления посадочного материала от вирусов и других патогенов. Этот метод называетсяклональным микроразмножением растенийи позволяет получать от одной меристемы сотни тысяч растений в год.

Третье направление связано сиспользованием изолированных клеток в селекции растений. Развитие данного направления позволяет получать быстрорастущие растения, устойчивые к различным неблагоприятным факторам окружающей среды: засухе, засолению, низким и высоким температурам, фитопатогенам, тяжелым металлам и др. Кроме того, это направление предусматриваетсоздание новых растенийпутем слияния изолированных протопластов и получения неполовых (соматических) гибридов. Перенос в изолированные протопласты чужеродных генов с помощью методов генной инженерии позволяет получать в дальнейшем растения с новыми наследуемыми свойствами. Так, например, культивирование изолированных пыльников и семяпочек на искусственных питательных средах дает возможность получатьгаплоиды, а культивирование зародышей – прием, позволяющий получатьрастения из невсхожих гибридных семян, оплодотворение в пробирке позволяетпреодолеть нескрещиваемость некоторых растений.