Gosudarstvennaya_farmakopeya_RB

Все ингредиенты растворяют в воде, прибавляют 2,5 мл 1 % раствора фе-

нолового красного, значение рН доводят таким образом, чтобы после стерилиза- ции оно составляло 7,4 ± 0,2. Кипятят 1 минуту, прибавляют агар, нагревают до

полного его расплавления, фильтруют через ватно-марлевый фильтр.

Стерилизуют в паровом стерилизаторе при температуре 1210С в течение 15

минут.

Среда № 11 – для предварительного обогащения энтеробактерий

Все компоненты растворяют в воде при нагревании, значение рН доводят таким образом, чтобы после стерилизации оно составляло 6,9 ± 0,1. Фильтруют

через бумажный фильтр.

Стерилизуют в паровом стерилизаторе при температуре 1210С в течение 15 минут.

Среда № 12 (селенитовая среда) – для накопления и выделения бактерий рода Salmonellа

Препарат гигроскопичен и светочувствителен.

Указанное в прописи количество тщательно размешивают в 1000 мл воды.

Колбу закрывают ватной пробкой, быстро доводят до кипения (до образования пу- зырьков) и сразу прекращают нагрев. рН после стерилизации - 7,5 ± 0,2.

Ингредиенты растворяют в воде при нагревании, значение рН доводят та-

ким образом, чтобы после стерилизации оно составляло 7,3 ± 0,2. Фильтруют че- рез ватно-марлевый фильтр.

Среду разливают в пробирки по 7 мл.

Стерилизуют в паровом стерилизаторе при температуре 1210С в течение

15 минут.

При охлаждении скашивают, оставляя столбик 2,5 - 3,0 см.

Среда № 14 (цитратный агар Симмонса)

Соли растворяют в воде, вносят агар и нагревают до полного его расплав-

ления, значение рН доводят таким образом, чтобы после стерилизации оно со-

ставляло 7,2 ± 0,1. Фильтруют через ватно-марлевый фильтр, добавляют 40 мл 0,2 % водного раствора бромтимолового синего.

Среду разливают в пробирку по 5-7 мл.

Стерилизуют в паровом стерилизаторе при температуре 1210С в течение 15 минут.

При охлаждении скашивают, оставляя столбик 2,0 - 2,5 см. Среда № 15 (бульон Хоттингера) – для определения индола

Гидролизат Хоттингера разводят водой до содержания в среде 120-140 мг% аминного азота, добавляют соли, значение рН доводят таким образом, чтобы по-

сле стерилизации оно составляло 7,5 ± 0,1. Кипятят 15 минут, фильтруют через бумажный фильтр.

Стерилизуют в паровом стерилизаторе при температуре 1210С в течение 15 минут.

Навеску NaCl помещают в мерную колбу на 1000 мл и доводят объем рас-

твора до метки очищенной водой. Раствор фильтруют через бумажный фильтр.

Стерилизуют в паровом стерилизаторе при температуре 1210С в течение 15

минут.

Растворы № 1 и № 2 стерилизуют в паровом стерилизаторе при температу- ре 1210С в течение 15 минут.

Навеску индикатора растирают в ступке, прибавляя небольшими порциями едкий натр. Полученный раствор переносят в мерную колбу вместимость 100 мл и доводят объем раствора до метки очищенной водой. Хранят во флаконе ней- трального светозащитного стекла при температуре от 40С до 100С.

Навеску красителя помещают в мерную колбу на 100 мл, доводят объем

раствора до метки стерильной горячей водой. Раствор выдерживают сутки в тер- мостате, периодически перемешивая.

Реактив Грисса

Раствор № 1: 0,5 г сульфаниловой кислоты растворяют в 30 мл ледяной

уксусной кислоты, прибавляют 100 мл воды, фильтруют.

Раствор № 2: 0,1 г 1-нафтиламина растворяют в 100 мл кипящей воды, ох- лаждают, прибавляют 30 мл ледяной уксусной кислоты, фильтруют.

Перед употреблением смешивают равные объемы растворов № 1 и № 2.

Реактив на цитохромоксидазу Раствор № 1: 1 % спиртовой раствор 1-нафтола.

Раствор № 2: 1 % раствор N, N-диметил-р-фенилендиамина дигидрохло-

рида.

Перед употреблением смешивают раствор № 1 и № 2 в соотношении 2:3.

Реактив Ковача

Навеску альдегида растворяют в спирте при легком нагревании (на водяной бане при 50-55 0С), охлаждают и медленно добавляют кислоту.

Навеску альдегида растворяют в спирте и медленно добавляют кислоту.

2.6.14. БАКТЕРИАЛЬНЫЕ ЭНДОТОКСИНЫ

Испытание на бактериальные эндотоксины проводят для определения на-

личия или количества эндотоксинов, источником которых являются грамотрица-

тельные бактерии, с использованием лизата амебоцитов мечехвоста Limulus polyphemus или Tachypleus tridentatus. Существует три принципа проведения данного испытания: принцип гель-тромба, основанный на образовании геля; турбидимет-

рический принцип, основанный на помутнении в результате расщепления эндо-

генного субстрата; хромогенный принцип, основанный на появлении окраски по- сле расщепления синтетического пептидно-хромогенного комплекса.

В настоящем разделе описаны шесть методов:

Метод А. Гель-тромб-метод: предельное испытание.

Метод В. Гель-тромб-метод: полуколичественное испытание. Метод С. Турбидиметрический кинетический метод.

Метод D. Хромогенный кинетический метод. Метод Е. Хромогенный метод конечной точки.

Метод F. Турбидиметрический метод конечной точки.

Испытание выполняют любым из этих шести методов. В сомнительных и

спорных случаях окончательное решение принимают, основываясь на методе А,

если иное не предписано в частной статье.

Испытание выполняют в условиях, не допускающих загрязнения посторон- ними эндотоксинами.

Оборудование

Всю стеклянную посуду и другую термоустойчивую аппаратуру депирогени-

зируют в сухожаровом шкафу с использованием процесса с подтвержденной эф- фективностью. Общеприняты минимальные значения времени и температуры об-

работки, составляющие 30 минут и 2500С, соответственно. При использовании

пластиковой аппаратуры, например, микротитрационных планшетов и наконечни- ков для автоматических пипеток, следует продемонстрировать отсутствие на ней поддающихся определению эндотоксинов и мешающих факторов.

Примечание: в данном разделе термин «пробирка» включает в себя все типы сосудов, например, микротитрационные планшеты.

Приготовление исходного стандартного раствора эндотоксина

Исходный стандартный раствор эндотоксина готовят из стандартного об-

разца эндотоксина, калиброванного по отношению к международному стандарту, например из Стандартного образца эндотоксина BRP.

Количественное содержание эндотоксина выражают в Международных Единицах (МЕ). Эквивалентность международного стандарта в международных единицах устанавливается Всемирной организацией здравоохранения.

Примечание: Одна международная единица (МЕ) эндотоксина эквивалент-

на одной единице эндотоксина (ЕЭ).

Исходный стандартный раствор эндотоксина готовят и хранят, следуя спе-

цификациям, приведенным на листке-вкладыше и этикетке.

Приготовление стандартных растворов эндотоксина

Необходимые последовательные разведения предварительно интенсивно пере- мешанного исходного стандартного раствора эндотоксина готовят с использова-

нием воды для испытания на бактериальные эндотоксины (вода для ИБЭ). Эти

растворы используют по возможности быстро, чтобы избежать потери активности вследствие адсорбции.

Приготовление испытуемых растворов

Испытуемые растворы готовят путем растворения или разбавления актив-

ных субстанций или медицинской продукции с использованием воды для ИБЭ. Для некоторых субстанций и препаратов более подходящим является растворе-

ние или разбавление с использованием других водных растворов. При необходи-

мости, доводят значение рН испытуемого раствора (или его разведения) так, что- бы рН его смеси с лизатом находилось в интервале, предписанном производите- лем лизата. Обычно это относится к продукции со значением рН в интервале от 6,0 до 8,0. Значение рН может быть доведено с использованием кислоты, основа- ния или подходящего буферного раствора, по рекомендациям производителя ли- зата. Кислоты и основания могут быть приготовлены из концентратов или порош-

ков с использованием воды для ИБЭ в контейнерах, не содержащих определяе-

мых количеств эндотоксина. Должно быть подтверждено отсутствие в буферных растворах отсутствие эндотоксинов и мешающих факторов.

Определение максимально допустимого разведения

Максимально допустимое разведение (МДР) - максимальное разведение образца, при котором может быть определено предельное содержание эндоток- сина. МДР вычисляют по формуле:

МДР = Предельное содержание эндотоксинов × Концентрация испытуемого раствора ,

λ

Предельное содержание эндотоксинов: для активных субстанций, предна-

значенных для парентерального введения, равно:

MK ,

где :

К- допустимая пирогенная доза эндотоксина, вводимая в течение часа на килограмм массы тела,

М- максимальная рекомендованная доза продукта, вводимая в течение ча- са на килограмм массы тела.

Предел эндотоксина для активных субстанций, предназначенных для па- рентерального введения, указывается в частных статьях и выражается в таких единицах, как МЕ/мл, МЕ/мг, МЕ/(единица биологической активности) и т.д.

Концентрация испытуемого раствора:

-в мг/мл, если предельное содержание эндотоксинов выражено в массовых еди- ницах (МЕ/мг),

-в Ед/мл, если предельное содержание эндотоксинов выражено в пересчете на единицу биологической активности (МЕ/Ед)

-в мл/мл, если предельное содержание эндотоксинов выражено в объемных еди- ницах (МЕ/мл).

λ - чувствительность лизата в гель-тромб-методе, указанная на этикет-

ке, или низшая точка стандартной кривой в турбидиметрических или хромогенных методах.

ПРИНЦИП ГЕЛЬ-ТРОМБА (МЕТОДЫ А И В)

Гель-тромб-методы позволяют определять наличие и количество эндоток-

синов и основываются на эффекте свертывания лизата в присутствии эндотокси- нов. Концентрация эндотоксинов, требующаяся для свертывания лизата в стан-

дартных условиях, представляет собой указанную на этикетке чувствительность

лизата. Для обеспечения точности и достоверности испытания указанную чувст- вительность лизата следует подтвердить, а также провести испытание на ме- шающие факторы, описанное в подразделе «1. Предварительные испытания».

1.ПРЕДВАРИТЕЛЬНЫЕ ИСПЫТАНИЯ

(i)Подтверждение заявленной чувствительности лизата

Перед использованием лизата в испытаниях указанную на этикетке чувст-

вительность λ, выраженную в МЕ/мл, следует подтвердить в четырех повторно-

стях. Подтверждение чувствительности лизата выполняют при использовании но- вой партии лизата или при любом изменении экспериментальных условий, спо- собном повлиять на результат испытания.

Готовят стандартные растворы не менее, чем четырех концентраций, экви- валентных 2λ, λ, 0,5λ и 0,25 λ, путем разбавления исходного стандартного раство- ра эндотоксина водой для ИБЭ.

В каждой из пробирок смешивают раствор лизата с равным объемом одного из стандартных растворов (например, по 0,1 мл каждого). Если используются од-

норазовые флаконы или ампулы с лиофилизированным лизатом, растворы до- бавляют непосредственно в ампулу или флакон. Реакционную смесь инкубируют

в течение определенного периода, в соответствии с рекомендациями производи- теля лизата (обычно 37±10С в течение 60±2 минут), избегая вибрации. Исследуют целостность геля: при использовании пробирок каждую из них по очереди извле- кают из инкубатора и переворачивают одним плавным движением приблизитель- но на 1800. Если образуется твердый гель, остающийся на своем месте после пе-

реворачивании, результат записывают как положительный. Результат отрица-

тельный, если неповрежденного геля не образуется.

Результаты испытания считают достоверными, если низшая концентрация

стандартных растворов во всех повторностях дает отрицательный результат.

За конечную точку принимают последний положительный результат в нис-

ходящем ряду концентраций эндотоксина. Вычисляют среднее значение лога- рифмов концентраций в конечных точках и, затем, антилогарифм этого среднего значения по следующей формуле:

Среднее геометрическое концентраций в конечных точках = antilog [(Σe)/f],

где:

Среднее геометрическое концентраций в конечных точках представляет со- бой измеренную чувствительность раствора лизата (МЕ/мл). Если это значение

составляет не менее 0,5λ и не более 2λ, чувствительность, указанную на этикетке, считают подтвержденной и используют в испытаниях, выполняемых с этим лиза-

том.

(ii) Определение мешающих факторов

Готовят растворы A, B, C и D в соответствии с Таблицей 2.6.14.-1 и исполь-

зуют не содержащий определяемых эндотоксинов испытуемый раствор в разве-

дении, меньшем МДР в соответствии с указаниями подраздела «1. Предвари- тельные испытания. (i) Подтверждение заявленной чувствительности лизата».

Таблица 2.6.14.-1

Раствор А – раствор испытуемого препарата, не содержащий эндотоксинов в оп-

ределяемых концентрациях, Раствор В – тест на мешающие факторы,

Раствор С – контроль чувствительности, указанной на этикетке, Раствор D – отрицательный контроль (вода для ИБЭ)

Среднее геометрическое концентраций в конечных точках для растворов В

и С вычисляют по формуле, приведенной в подразделе «1. Предварительные ис- пытания. (i) Подтверждение заявленной чувствительности лизата».

Испытание на мешающие факторы повторяют в случае любых изменений экспериментальных условий, которые могут повлиять на результат.

Результаты испытания считают достоверными, если растворы А и D во всех повторностях дают отрицательный результат, а результат, полученный для рас-

твора С, подтверждает чувствительность лизата, указанную на этикетке.

Если чувствительность лизата, определенная для раствора В, не менее

0,5λ и не более 2λ, считают, что испытуемый раствор в условиях испытания не содержит мешающих факторов. В иных случаях раствор оказывает влияние на

результат испытания.

Если испытуемый препарат оказывает влияние на результат испытания в

разведениях менее МДР, испытание на мешающие факторы повторяют с исполь- зованием больших разведений, но не превышающих МДР. Использование более

чувствительного лизата позволяет применять большие разведения испытуемого препарата, и это может содействовать исключению мешающих факторов.

Мешающие факторы могут быть удалены соответствующей обработкой, на- пример, путем фильтрации, нейтрализации, диализа или теплового воздействия.

Для того, чтобы установить, что выбранный метод эффективно исключает ме-

шающие факторы, не удаляя эндотоксины, испытания повторяют с использовани- ем образца испытуемого препарата, к которому был добавлен стандартный обра-

зец эндотоксина и проведена выбранная процедура удаления мешающих факто-

ров.

2.ПРЕДЕЛЬНОЕ ИСПЫТАНИЕ (МЕТОД А)

(i)Методика

Готовят растворы A, B, C и D в соответствии с Таблицей 2.6.14.-2 и выпол- няют испытание для этих растворов в соответствии с указаниями подраздела «1. Предварительные испытания. (i) Подтверждение чувствительности лизата, ука- занной на этикетке».

Растворы А и В (положительный контроль с препаратом) готовят в разведе-

ниях не выше МДР и обрабатывают в соответствии с указаниями подраздела «1.

Предварительные испытания. (ii) Определение мешающих факторов». Растворы

В и С (положительные контроли) содержат стандарт эндотоксина в концентрации,

соответствующей двукратной заявленной чувствительности. Раствор D (отрица- тельный контроль) представляет собой воду для ИБЭ.

(ii) Интерпретация

Результаты испытания считают достоверными, если положительные кон-

трольные растворы В и С в обеих повторностях дают положительный результат, а раствор D – отрицательный результат.

Испытуемый препарат выдерживает испытание, если для раствора А в обе- их повторностях получен отрицательный результат.

Если для раствора А в обеих повторностях получен положительный резуль-

тат:

-если при этом испытуемый раствор разбавлен до МДР, он не выдерживает ис- пытание,

-если степень разведения препарата менее МДР, испытание повторяют с исполь- зованием разведения, не превышающего МДР.

Вслучае, если для одной из повторностей раствора А получен положитель-

ный результат, а для другой – отрицательный, испытание повторяют. Испытуемый препарат выдерживает испытание, если в повторном эксперименте для раствора А в обеих повторностях получен отрицательный результат.

2.ПОЛУКОЛИЧЕСТВЕННОЕ ИСПЫТАНИЕ (МЕТОД В)

(i)Методика

С помощью данного испытания определяют количество бактериальных эн-

дотоксинов путем титрования до конечной точки. Готовят растворы A, B, C и D в

соответствии с Таблицей 2.6.14.-3 и выполняют испытание для этих растворов в соответствии с указаниями подраздела «1. Предварительные испытания. (i) Под- тверждение заявленной чувствительности лизата».

Таблица 2.6.14.-3.

Раствор А – испытуемый раствор в разведении, не превышающем МДР, с кото- рым проводилось определение мешающих факторов. Последующие разведения

испытуемого раствора не должны превышать МДР. Используют воду для ИБЭ для получения двух рядов разведений в отношениях 1, 1/2, 1/4 и 1/8к разведению, с

которым проводилось определение мешающих факторов. При необходимости мо- гут быть использованы и другие разведения,

Раствор В – раствор А, содержащий стандарт эндотоксина в концентрации 2λ (по-

ложительный контроль с препаратом),

Раствор С – два ряда разведений воды для ИБЭ, содержащей стандарт эндоток-

сина в концентрациях 2λ, 1λ, 0,5λ, 0,25λ,

Раствор D – вода для ИБЭ (отрицательный контроль).

(ii) Вычисления и интерпретация

Результаты испытания считают достоверными при выполнении следующих

трех условий:

(а) раствор D (отрицательный контроль) в обеих повторностях дает отрица-

тельный результат,

(б) раствор В (положительный контроль с препаратом) в обеих повторно-

стях дает положительный результат,

(с) среднее геометрическое концентраций в конечных точках для раствора С находится в пределах от 0,5λ до 2λ.

Для определения концентрации эндотоксинов в растворе А вычисляют кон- центрации в конечных точках для каждого ряда разбавлений в каждой из повтор- ностей путем умножения фактора разбавления в конечной точке на λ.

За концентрацию эндотоксина в испытуемом растворе принимают среднее

геометрическое концентраций в конечных точках в повторных экспериментах (см. формулу в подразделе «1. Предварительные испытания. (i) Подтверждение чув-

ствительности лизата, указанной на этикетке»). Если испытание проводят с раз-

бавленным испытуемым раствором, концентрацию эндотоксина в исходном рас- творе получают путем умножения на фактор разбавления.

Если ни одно из разведений испытуемого раствора в ходе испытания с под- твержденной достоверностью не дает положительного результата, концентрацию эндотоксинов регистрируют как «менее λ» (или, в случае использования разбав- ленного образца, как «менее (λ × наименьший фактор разведения образца)»). Ес-

ли для всех разведений получен положительный результат, то концентрация эн-

дотоксинов регистрируется как «равная или превышающая максимальный фактор разведения, умноженный на λ» (например, в Таблице 2.6.14.-3, это значение рав- но исходному фактору разведения × 8 × λ).

Препарат соответствует требованиям испытания, если концентрация эндо- токсина менее указанной в частной статье.

ФОТОМЕТРИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ (МЕТОДЫ С, D, E и F)

1. ТУРБИДИМЕТРИЧЕСКИЙ ПРИНЦИП (МЕТОДЫ С и F)

Данный принцип представляет собой фотометрическое испытание, основанное на измерении увеличения степени мутности. В зависимости от используемого подхо- да, с использованием данного метода могут быть проведены турбидиметрическое