Лекция 4

Липидные рафты

Существование липидных рафтов было открыто при изучении чувствительности плазматической мембраны к различным детергентам. Было установлено, что есть устойчивые к неионным детергентам участки мембран, богатые сфинголипидами и холестеролом, имеющие другие свойства, чем остальная часть мембраны.

Впервые идентифицированные по нечувствительности к неионным детергентам, рафты считаются динамичными субмикроскопическими ансамблями, которые свободно перемещаются в неупорядоченном липидном бислое клеточной мембраны и могут объединяться, формируя кластеры.

Структура рафтов представляется как асимметричный бислой, в котором сфинголипиды локализованы в экзоплазматическом слое, а глицерофосфолипиды (типа фосфатидилсерина и фосфатидилэтаноламина) локализованы во внутреннем, цитоплазматическом слое, холестерол присутствует в обоих. Сфинголипиды и холестерол наружного листка бислоя играют критическую роль в формировании рафтов. Рафты окружены жидким бислоем, образованным в основном ненасыщенными фосфатидилхолинами. Два слоя мембраны в области рафтов соединяются интердигитацией длинных N-ацильных цепей сфинголипидов, в цитоплазматическом слое холестерол интеркалирован глицерофосфолипидами.

В модельных мембранах липидные рафты, как полагают, существуют в отдельной фазе, сходной с фазой организации липидов (lo). Ацильные цепи липидов этой фазы длинные, плотно упакованные и упорядоченные. Присутствие необычно длинных насыщенных ацильных цепей в смеси фосфолипидов, сфинголипидов и холестерола, взятых в концентрациях, аналогичных таковым в плазматической мембране, при температуре 37оС, приводит к разделению фаз и формированию lo фазы. Эта модель, полагают, соответствует формированию рафтов в биологических мембранах.

Температура плавления длинных насыщенных ацильных цепей и сфинголипидов опосредует их ассоциацию в домены, устойчивые к детергентам. Эти домены, богатые сфинголипидами и холестеролом, имеют свойства упорядоченной жидкой lo фазы, описанной выше для модельных мембран («гель» в ряде публикаций). Считают, что детергент-устойчивые мембраны, выделенные из клеток, происходят из липидных рафтов, и не являются артефактом.

Было показано, что рафты содержат арахидоновую кислоту и фосфатидилсерин, что говорит об их важной роли в передаче соответствующих сигналов.

В настоящее время меняются взгляды на организацию клеточных мембран. Липидный бислой больше не считается гомогенной жидкостью, в которой перемещаются мембранные белки. В 1997 году известный немецкий ученый Кай Зимонс выдвинул революционную теорию «липидных рафтов»: липидная мембрана представляет собой динамичную, постоянно изменяющуюся среду, чутко реагирующую на все события, происходящие внутри и вокруг клетки. Определенные участки мембраны самоорганизованы в обогащенные холестеролом рафты (англ. raft – плот), более плотные, чем остальные области, и потому свободно дрейфующие в окружающем пространстве. В зависимости от происходящих в жизни клетки событий, эти «плотики» способны собираться в большие платформы, и тогда молекулы белков, которые до того находились на разных «плотах», получают возможность встретиться и вступить во взаимодействие. Т.е., имеется селективная фиксация белков и липидов в ограниченных участках мембраны, называемых липидными рафтами. С рафтами ассоциированы определенные классы белков.

Липидные рафты были «узаконены» в 2006 г. на Keystone Symposium on Lipid Rafts and Cell Function, и им было дано следующее определение:

«Membrane rafts are small (10–200nm), heterogeneous, highly dynamic, sterol- and sphingolipid-enriched domains that compartmentalize cellular processes. Small rafts can sometimes be stabilized to form larger platforms through protein–protein and protein–lipid interactions».

Рафты слишком малы, чтобы их увидеть, и достаточно долго были сомнения в их существовании. Некоторые доказательства существования рафтов:

- устойчивость к детергентам;

- локальные изменения текучести плазматической мембраны;

- формирование кластеров. Антитела, антигены и белки, связывающиеся с рафтами (холерный токсин), организуют кластеры на наружной стороне мембраны, а аннексины, флотилины и другие «скелетные» белки организуют кластеры на внутренней стороне мембраны.

Формирование более крупных кластеров или доменов обеспечивается в основном взаимодействием холестрола и сфинголипидов. Эти взаимодействия приводят к образованию бислойной фазы с перемещением молекул, а углеводные цепи «организуют» промежуток между «жидким» фосфолипидным бислоем и «гелем» (организованным)-бислоем (рафтовая часть).

В настоящее время в существовании рафтов никто не сомневается, - опубликовано множество работ, показывающих «меченые» разными способами рафты.

Плоские рафты - мелкие, 5-200 нм, что, вместе с их высокой подвижностью, осложняет их прямую визуализацию в мембране неповрежденной клетки. Визуализация возможна с помощью флуоресцентного мечения «рафтовых» белков, либо методом имунноэлектронной микроскопии с использованием меченых антител.

Рафты существуют независимо от белков, и функционируют исключительно за счет взаимодействия липидов. Предполагается, что функция липидных рафтов – пространственная концентрация специфических наборов белков для увеличения эффективности и специфичности передачи сигналов путем усиления взаимодействия между белками и путем предупреждения перекреста между потоками сигналов и возникновения помех. Для молекулярной медицины рафты стали недостающим звеном в понимании механизмов развития многих заболеваний. Многие вирусы используют зоны рафтов для своего проникновения и почкования. Так, ученые быстро обнаружили, что вирусы (в том числе и ВИЧ) выбирают своей мишенью в клеточной мембране именно липидные «плоты», забрасывают туда прочный «якорь», после чего начинают свое проникновение в клетку.

Развитием теории липидных рафтов является теория липидного матрикса, в соответствии с которой в настоящее время можно выделить 4 типа пространственной организации молекул плазматической мембраны, описывающих их пространственные взаимоотношения. Теория предполагает, что каждый белок по-своему взаимодействует с разными типами липидов.

1. «Организованные» (упорядоченные) структуры, в которых главным формообразующим фактором являются мембранные белки. Например, соединения между мембранами клеток, «опушенные» ямки.

2. «Жидкие» неупорядоченные участки, в которых олигомерные белки находятся в «жидкой» фазе липидного бислоя, окруженные липидами, не входящими в структуру бислоя.

3. «Жидкие» упорядоченные участки, образованные за счет взаимодействия стеролов с полярными липидами мембран. У млекопитающих эти участки состоят из стехиометрического комплекса, образованного симметричными молекулами сфинголипидов и холестерола в соотношении 1,7 : 1. Эти домены в основном лишены трансмембранных белков, и содержат белки, заякоренные на липидах, либо трансмембранные белки, имеющие «специальные» домены связывания с липидами рафтов.

4. Квази-кристаллические участки между асимметричными сфинголипидами и фосфолипидами. Эти участки имеют свойства «организованной (упорядоченной) жидкой» фазы («геля»), и отграничены от «жидкой» фазы углеводными цепями, которые играют роль промежуточной зоны между «гелем» и «жидкой неорганизованной» фазой. Полагают, что полярные группы асимметричных сфинголипидов, которые часто имеют сложные углеводные структуры, обеспечивают базу для специфического взаимодействия с белками рафтов. Другой возможный механизм специфического взаимодействия с белками рафтов – интеркаляция GPI – якорей в квазикристаллическую структуру с асимметричными сфинголипидами.

GPI – glycosylphosphatidylinositol – гликозилфосфатидилинозитол

Теория липидного матрикса – новая, и пока даже не обсуждается активно. Идет накопление знаний.

Липидная асимметрия (неслучайное распределение различных видов липидов в бислое) – общая черта мембран эукариотических клеток. Липидная асимметрия создает две стороны мембраны с различными биофизическими свойствами и влияет на различные функции клеток. В основе липидной асимметрии лежат разные свойства составляющих мембрану липидов, а также работа ферментов, переносящих липиды через бислой. Изменение асимметрии играет важную роль в слиянии клеток, активации коагуляции крови, распознавании и удалении фрагментов клеток после апоптоза.

Формирование пузырьков – важное свойство плазматической мембраны, обусловленное её способностью к деформации и обеспечивающее поступление в клетку самых различных веществ. Клатрин и кавеолин – «главные» деформирующие («покрывающие, одевающие» (coat)) белки, широко распространенные в клетках. Другие белки, например, флотилин, встречаются реже.

Механизмы, обеспечивающие деформацию мембраны и формирование пузырьков, полностью не поняты, и являются предметом активных исследований. Одна из причин – разнообразие пузырьков в разных клетках и участие различных дополнительных молекул, что приводит к огромному массиву данных, которые пока не удается обобщить. В клетке существует множество мембран, обменивающихся между собой молекулами и фрагментами посредством пузырьков, - так называемый пузырьковый транспорт. В данный момент речь идет о плазматической мембране и формировании пузырьков, которые доставляют вещества и фрагменты мембран внутрь клетки.

Основные деформирующие плазматическую мембрану белки высококонсервативны.

Клатрины – основной компонент клатрин-покрытых (опушенных, одетых) ямок (clathrin-coated pits) – присутствуют в клетках дрожжей, растений и животных. Они консервативны у млекопитающих, однако различаются у крыс, коров и человека. Различия структуры клатрина у дрожжей и млекопитающих сосредоточены в легкой цепи, тогда как тяжелая цепь высококонсервативна.

Кавеолины – были открыты как структурные маркеры кавеол и являются их компонентом. Присутствуют в клетках позвоночных и беспозвоночных животных, и не найдены в клетках растений, дрожжей и амеб. Известны три изоформы кавеолина: кавеолин-1a, кавеолин-1b, -2a, -2b, и -3. Кавеолин-1 и кавеолин-3 необходимы для формирования кавеол, тогда как кавеолин-2 играет вспомогательную роль.

Динамины – ГТФ-азы, участвующие в отделении эндоцитозного пузырька от мембраны. Найдены в клетках грибов, амеб, растений и животных. Очень вариабельны и специализированы, различаются даже у разных млекопитающих.

ЭНДОЦИТОЗ

Разновидности и механизмы эндоцитоза

В широком смысле слова понятие «эндоцитоз» означает «поглощение, попадание внутрь клетки». В настоящее время этот термин используют для обобщения всех путей поступления веществ в клетку, при которых формируется углубление плазматической мембраны и попадающее в клетку вещество ею окружается. По сути, эндоцитоз является механизмом интернализации внеклеточных компонентов и фрагментов плазматической мембраны, которая формирует эндоцитозный пузырек или вакуоль. Т.о., эндоцитоз – обобщенный термин, означающий интернализацию внеклеточных компонентов посредством пузырьков, формируемых плазмалеммой.

Существует два больших класса эндоцитоза:

1. интернализация микродоменов плазматической мембраны в виде небольших (около 100 нм) пузырьков или трубочек;

2. интернализация макродоменов плазматической мембраны, когда формируются крупные пузыри (вакуоли) и интернализуются частицы микронных размеров.

Среди типов эндоцитоза 1 класса наиболее изучен

1. Клатрин-зависимый тип эндоцитоза.

Наиболее хорошо изучен и понят. Ранее его называли «Рецептивный» (рецепторно

зависимый) эндоцитоз (Receptor-mediated endocytosis). Главной особенностью этого типа эндоцитоза является интернализация лиганд-рецепторных комплексов. Одна из функций плазматической мембраны – прием информации в виде молекулярных сигналов извне и ее передача в клетку по строго определенному адресу. Прежде всего, речь идет о передаче регуляторных сигналов, в частности, гормональных, однако в клетку поступает и другая многообразная «молекулярная» информация. В клетке существуют разные механизмы передачи сигналов, обеспечивающие адресную доставку молекулярного сигнала, сортировку сигнальных молекул, и клатрин-зависимый тип эндоцитоза занимает важное место в этих процессах.

Клатрин-зависимый эндоцитоз хорошо визуализируется в электронном микроскопе, благодаря наличию «зубчиков» клатрина на цитоплазматической стороне плазмалеммы, участвующей в эндоцитозе. Клатрин придает эндоцитозным структурам «опушенный» вид.

В процессе клатрин-зависимого эндоцитоза выделяют следующие стадии:

Распознавание белковой молекулы (лиганда) рецептором;

Формирование лиганд-рецепторного комплекса;

Образование «опушенной» ямки (coated pit);

Образование «опушенного» пузырька (coated vesicle);

Отделение опушенного пузырька от плазмалеммы;

Формирование эндоцитозного пузырька;

Перенос лиганд-рецепторного комплекса в раннюю эндосому;

Процессинг лиганд-рецепторного комплекса, сортировка.

Клатрин – фибриллярный белок цитозоля, состоящий из трех ветвей, расположенных под определенным углом друг к другу, и способный к самосборке с формированием корзинковидных структур. Формирование лиганд-рецепторного комплекса на поверхности плазмалеммы является сигналом к полимеризации клатрина, в результате которой происходит искривление плазматической мембраны и формирование «опушенной» ямки и «опушенного» пузырька. После отделения пузырька клатриновая корзинка деполимеризуется, пузырек становится «гладким». Эндоцитозный пузырек мигрирует от плазмалеммы в цитоплазму и сливается с ранней эндосомой. Таким образом, клатриновые пузырьки в процессе эндоцитоза переносят участки плазмалеммы в цитоплазму, где они сливаются с мембраной ранних эндосом. Кроме интернализации макромолекул, в процессе клатрин-зависмого эндоцитоза осуществляется обновление плазматической мембраны.

Клатрин не может сам связываться с мембраной и с лигандами, для этого нужны белки-адаптеры. Известно около 20 форм белков-адаптеров клатрина. Кроме клатрина и белков-адаптеров, в клатрин-зависимом эндоцитозе участвует актин, хотя его роль не всегда очевидна.

Отделение «опушенного» пузырька от мембраны обеспечивается динамином, 100-кДа ГТФазой, имеющей в клетках млекопитающих 3 изоформы (динамин-1, -2 и -3). Динамин-3 наиболее распространен.

Ранняя эндосома – конечная точка транспорта макромолекул и место, где начинает реализовываться их «программа». Ранние эндосомы существуют в клетке, и являются частью эндосомально-лизосомальной системы. Назначение ранних эндосом в клатрин-зависимом эндоцитозе – диссоциация лиганд-рецепторного комплекса и сортировка рецепторов, которая обеспечивается кислым рН. В ранней эндосоме нет гидролаз. Маркеры ранних эндосом:

• Early Endosome Associated Protein (EEA-1)

• Rabaptin-5

• рН=5,9-6.

Клатрин-зависимый эндоцитоз обеспечивает проникновение в клетку многих белковых гормонов, используется вирусами. Этот тип эндоцитоза намного лучше изучен, чем все остальные разновидности эндоцитоза, и поэтому создается ложное впечатление, что тот путь обеспечивает основную долю эндоцитируемого материала. На самом деле, в зависимости от типа клеток, примерно половина – клатрин-зависимый эндоцитоз, и половина – клатрин-незвисимый.

Механизмы, регулирующие формирование эндоцитозных пузырьков и интернализацию связавшихся с поверхностью клетки молекул и несвязанных, находящихся в просвете пузырьков, варьируют в зависимости от типа молекулы и типа клеток. Картина усложняется наличием разных путей эндоцитоза в одной клетке и неспецифичностью связывания некоторых молекул. Одним из ключевых является вопрос: захватывает ли уже существующий пузырек молекулы, или их связывание с поверхностью клетки индуцирует формирование пузырька?

В случае клатрин-зависимого эндоцитоза это определяется типом захватываемой молекулы (лиганда). Ряд лигандов индуцирует формирование новых «опушенных» ямок (рецептор фактора роста эпидермиса, различные патогены). Другие лиганды стабилизируют существующие ямки и используют их для интернализации (рецептор трансферрина, рецептор липопротеинов низкой плотности). Первый вариант – конституитивный эндоцитоз, второй – лиганд-индуцированный.

Клатрин-зависимый эндоцитоз – очень эффективный сортировочный механизм, опушенные ямки могут накапливать на порядок больше рецепторов, чем находится на ровной поверхности клетки.

Кавеолы – специальный тип липидных рафтов, являются инвагинациями липидного бислоя плазмалеммы. Они вовлечены в большой набор клеточных процессов, включая передачу сигналов, эндоцитоз, трансцитоз и транспорт холестерола. Кавеолы есть не во всех типах клеток. Так, их много в клетках эндотелия, жировых и мышечных клетках – они могут занимать до 35% клеточной поверхности. В то же время они не обнаружены в нейронах и лимфоцитах. Кавеолы могут располагаться как по всей поверхности клетки, так и на одной из поверхностей (в эпителии), могут образовывать цепочки и кластеры (розетки), везикуло-вакуолярные органеллы. В эндотелии кавеолы могут образовывать каналы, проходящие через клетку.

Существуют две формы кавеол: мелкие и глубокие.

Формирование кавеол обеспечивается белками кавеолинами, которые деформируют фосфолипидный бислой, взаимодействуя с холестеролом. Кавеолин-1 – интегральный белок плазмалеммы с центральным гидрофобным доменом, формирующим петлю. Оба конца, и N, и C выходят в цитоплазму, т.е., кавеолин-1 имеет топологию шпильки (hairpin). Кавеолин-1 – основной формообразующий белок кавеол, он формирует «скелет» кавеолы вместе с другими формами кавеолина. «Скелет» определяет форму кавеол, размеры и многие их свойства. Недавно открытые белки кавины формируют наружный периферический слой, имеют форму крупных гетероолигомерных комплексов, покрывающих изогнутую мембрану кавеолы. Полагают, что кавины стабилизируют «скелет» кавеолы, обеспечивают изгиб мембраны, участвуют в почковании кавеолы.

Генетический анализ показал высокую консервативность кавеолинов. На мышах показано, что нарушение экспрессии кавеолина-1 связано с развитием рака, диабета, сосудистых и урогенитальных аномалий, болезней глаз, легких, мышечной дистрофии и кардиомиопатии.

Кавеолы стабильны и долго существуют в мембране, а кавеолины – исключительно долгоживущие белки. В отличие от «клатриновых» пузырьков, кавеолы не сбрасывают свое кавеолиновое «покрытие» при отшнуровке и попадании в цитоплазму.

Кавеолы имеют четкую спиральную исчерченность на цитозольной стороне, в отличие от зубчиков клатрина на поверхности «опушенных» пузырьков. Остальные типы пузырьков имеют гладкую поверхность и этим отличаются от кавеол и «опушенных» пузырьков.

Факт, что липидные рафты могут формироваться в мембранах цитоплазматических структур, в частности, в АГ, предполагает возможный механизм биогенеза кавеол. Синтез кавеолина происходит на мембранах ЭПР, молекулы закрепляются «крючком» через внутренний листок мембраны ЭПР. Вскоре после синтеза мономеры кавеолина олигомеризуются в гептамеры, которые фосфорилируются, чтобы предупредить преждевременную сборку. Фосфорилированные олигомеры переносятся посредством COPII-пузырьков в АГ, где дефосфорилируются. Гипотетически холестерол встраивается в участки мембраны, в которые встроен кавеолин, и тогда эти участки, содержащие гептамеры кавеолина и холестреол, изгибают мембрану и формируют фрагмент рафта кавеол. Именно асимметрично встроенный в мембрану кавеолин обеспечивает создание изгибающего момента и задает в конечном счете форму кавеол. Т.е., липидные рафты, обогащенные кавеолином, образуются на мембранах АГ, затем транспортируются к плазмалемме, где они сливаются, накапливаются и формируют кавеолу «привычной» формы. Перенос кавеолинового «скелета» к плазмалемме происходит путем специального пузырькового транспортного пути.

Кавеолин-зависимый эндоцитоз

Гипотеза о существовании клатрин-независимого эндоцитоза появилась лишь в начале 1990-х, до этого времени всё прекрасно объяснялось клатрин-зависимым эндоцитозом. Предположение о связи кавеол с эндоцитозом появилось после открытия связи динамина с кавеолами – уже было известно, что динамин обеспечивает «отшнуровку» «опушенного» пузырька при клатрин-зависимом эндоцитозе. Соответственно, динамин может «отшнуровывать» и кавеолу. Постепенно накопились разные данные о существовании эндоцитоза посредством кавеол.

Обычно кавеолы – стационарные структуры плазмалеммы, их интернализация не происходит даже при сильных воздействиях специфических лигандов. Это не исключает возможность воздействия на кавеолы какими-то путями, однако их надо показать.

Отшнуровка кавеол и их перемещение считаются установленным механизмом, хотя детальных картинок не опубликовано. Вместе с тем, считается, что есть и механизм «kiss-and-run», когда «бегающая» кавеола получает «что-то» и переносит из стационарной.

Кавеосомы, ранее считавшиеся «специальными эндосомами» для кавеолин-зависимого эндоцитоза, оказались глубокими инвагинациями плазмалеммы с кавеолами. Это было показано ЭМ с использованием метки рутениевым красным. Мембраны этих структур содержат много кавеолинов, что дает основание полагать, что они образуются при гиперэкспрессии кавеолина, или его мутантных форм. Опубликованы также данные, что кавеосомы являются частью эндосомо-лизосомальных структур. Предлагается термин «кавеосома» впредь не использовать.

Полагают, что из кавеол лиганды попадают в раннюю эндосому, однако точный механизм этого процесса не установлен. Очевидно, что имеет место пузырьковый транспорт.

Кавеолы и их кластеры обеспечивают эндоцитоз ряда белков и многих патогенов, включая вирусы, бактерии, грибы, прионы.

Клатрин- и кавеолин-независимый (рафт-зависимый эндоцитоз)

По мере накопления знаний о механизмах эндоцитоза становилось очевидно, что существуют четко различающиеся варианты эндоцитоза, помимо клатрин- и кавеолин-зависимого, обеспечивающие интернализацию микродоменов плазмалеммы.

Клатрин- и кавеолин-независимый, GPI-связанный эндоцитоз.

Эндоцитоз этого типа также обеспечивает интернализацию микродоменов, и протекает в клетках при блокировании клатрин-зависимого и кавеолин-1 зависимого эндоцитоза. Этот вариант эндоцитоза зависит от наличия холестерола, т.е., представляет собой разновидность эндоцитоза, зависящую от определенной композиции липидов в мембране (рафт-зависимый эндоцитоз). Показано, что данная разновидность эндоцитоза, в частности, обеспечивает интернализацию внеклеточной жидкости, вируса SV40, холерного токсина, некоторых сфинголипидов, рецепторов интерлейкина-2, гормона роста, эндотелина и многих других белков. Все эти белки связываются с плазматической мембраной посредством трансмембранных белков, имеющих гликозилфосфатидилинозитоловый якорь (glycosylphosphatidylinositol anchor) - GPI-linked proteins. Эти заякоренные связывающие белки локализуются в детергент-устойчивых областях плазмалеммы и не содержатся в области клатриновых пузырьков и кавеол. Лиганды, интернализуемые путем данного эндоцитоза, также попадают в эндосому, однако динамика этого процесса отличается от таковой при других типах эндоцитоза.

Морфологически этот вариант эндоцитоза выглядит как интернализация трубочек или кольцеобразных структур.

Механизмы всех вариантов этого типа эндоцитоза точно не установлены, постоянно появляются новые данные. Некоторые авторы различают типы эндоцитоза по участию в них динамина.

Эндоцитоз рецептора интерлейкина 2β - морфологически – везикулы, но обсуждается и вариант трубочек. Интернализация не только рецептора интерлейкина 2β, но и ряда других рецепторов цитокинов.

Arf6 –зависимый эндоцитоз. Морфология: везикулы и/или трубочки. Интернализация белков главного комплекса гистосовместимости класса 1, CD59, карбоксипептидазы Е.

ARF6 - ADP-ribosylation factor 6 (фактор 6 рибозилоирования) – фактор рибозилирования АДФ семейства ГТФ-связывающих белков (a member of the ADP ribosylation factor family of GTP-binding proteins).

ARF6 имеет в клетке много функций, связанных с трафиком мембран и трансмембранных белков.