Мед энзимология

ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «ВОРОНЕЖСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

МЕДИЦИНСКАЯ ЭНЗИМОЛОГИЯ

Учебное пособие

Составители: Т.Н. Попова Т.И. Рахманова С.С. Попов

Издательско-полиграфический центр Воронежского государственного университета

2008

3

ВВЕДЕНИЕ. ЗАДАЧИ И НАПРАВЛЕНИЯ МЕДИЦИНСКОЙ ЭНЗИМОЛОГИИ

К настоящему времени получены убедительные доказательства, что современная биология и медицина говорят на языке энзимологии и что возможности применения ферментов в медицине теоретически безграничны. Появилась новая дисциплина – медицинская биохимия, развивающаяся в соответствии с практическими запросами медицины. Медицинской биохимии принадлежит существенная роль в процессе познания патогенетических механизмов. Еще два века назад М.В. Ломоносов писал, что «медик без довольного знания химии совершенно быть не может».

Основная задача медицинской биохимии заключается в выяснении компенсаторных механизмов нарушенных этапов метаболических процессов в клетке и способов управления этой компенсацией. Успешно развивается новое направление энзимологии – медицинская энзимология, которая имеет свои цели и задачи, специфические методологические подходы и методы исследования. Медицинская энзимология развивается по трем главным направлениям: энзимопатологии, энзимодиагностики и энзимо- терапии.

Область исследований энзимопатологии является теоретической, фундаментальной частью патологии. Она призвана изучать молекулярные основы развития патологического процесса, исходя из данных о нарушениях механизмов регуляции активности или синтеза индивидуального фермента или группы ферментов. По мере углубления наших представлений о механизмах различных ферментативных реакций все более становится ясно, что энзиматические нарушения в той или иной степени сопровождают любой патологический процесс в организме. Наиболее ярким примером этого могут быть молекулярные болезни, называемые также на- следственные энзимопатии. Это генетически обусловленные нарушения биосинтеза какого-либо фермента, когда в тканях не продуцируется один из жизненно важных энзимов, и организм утрачивает «ключи» от определенного звена метаболизма, что становится несовместимым с нормальной жизнедеятельностью. В основе таких нарушений (большинство из них встречаются редко) лежит мутация какого-нибудь гена, кодирующего определенный фермент. Под контролем мутантного гена синтезируется дефектный фермент, у которого в том или ином ключевом участке полипептидной цепи может стоять «неправильная» аминокислота; кроме того, ка- кой-нибудь аминокислотный остаток может быть утрачен или, наоборот, включен в полипептидную цепь. В одних случаях такой наследственно измененный фермент неактивен вообще, а в других проявляет лишь часть присущей ему активности, поскольку характерное для него значение Км (или Vmax) не соответствует норме. Большинство наследственных энзимопатий сопровождается накоплением промежуточных продуктов обмена.

4

При некоторых заболеваниях такого рода нарушается нормальное развитие нервной ткани, что приводит к умственной отсталости. Примером может являться фенилпировиноградная олигофрения (фенилкетонурия). Этот аферментоз по фенилаланингидролазе (называемой также фенилаланин-4- монооксигеназой), катализирующей первый этап фенилаланинтирозинового метаболического пути, а именно гидроксилирование фенилаланина до тирозина, встречается у одного ребенка на каждые 15 000– 20 000 обследованных. Нормальное умственное развитие такого ребенка зависит от ранней диагностики и своевременного назначения специальной диеты.

По классификации А.А. Покровского к ферментопатиям относятся: 1) наследственные энзимопатии; 2) токсические энзимопатии; 3) алиментарные энзимопатии, вызванные нарушениями нейрогуморальных регуляций; и 4) группа различных патологических процессов, сопровождающихся нарушением и/или изменением ферментативных реакций.

Энзимопатология успешно решает и проблемы патогенеза соматических болезней. Созданы крупные научные центры и научноисследовательские институты, в которых ведутся работы по выяснению молекулярных основ атеросклероза, злокачественного роста, ревматоидных артритов и др. Нетрудно представить огромную роль ферментных систем или даже отдельных ферментов, нарушение регуляции активности

исинтеза которых приводит к формированию или развитию патологического процесса.

Второе направление медицинской энзимологии – энзимодиагностика – развивается по двум путям. Один путь – использование ферментов в качестве избирательных реагентов для открытия и количественного определения нормальных или аномальных химических веществ в сыворотке крови, моче, желудочном соке и др. (например, выявление при помощи ферментов глюкозы, белка или других веществ в моче, в норме не обнаруживаемых). Другой путь – открытие и количественное определение самих ферментов в биологических жидкостях при патологии. Оказалось, что ряд ферментов появляется в сыворотке крови при распаде клеток (отсюда их название «некротические ферменты»).

Для диагностики органических и функциональных поражений органов и тканей широко применяются отдельные ферментные тесты, выгодно отличающиеся от других химических диагностических тестов, используемых в клинике, высокой чувствительностью и специфичностью. Известно около 20 тестов, основанных на количественном определении активности ферментов (и изоферментов), главным образом в крови (реже в моче), а также в биоптатах (кусочки тканей, полученные при биопсии). В практическом плане энзимологические тесты должны помогать в ранней постановке

идифференциации диагноза, информировать о возможном исходе болезни

иэффективности применяемой терапии. Теоретические аспекты медицин-

5

ской энзимологии сводятся, в основном, к выяснению наиболее полной и достоверной картины патогенеза и этиологии заболевания, т.е. в конечном итоге к познанию молекулярных механизмов нарушений метаболических процессов.

Успехи клинической энзимологии позволяют в настоящее время получить ценные и многосторонние показатели для диагностики заболевания. Однако для правильной интерпретации результатов проведенных исследований обязательным является сопоставление энзимопоказателей с клинической картиной болезни в целом. В большинстве случаев биохимические тесты не определяют, а только подкрепляют и обосновывают поставленный диагноз. При оценке выявленных нарушений необходима определенная осторожность, так как один и тот же энзиматический сдвиг может являться звеном патогенетической причинной цепи или характеризовать вторичные механизмы, сопутствующие данной форме патологии, или, наконец, быть связанным со стереотипной, неспецифической реакцией организма на заболевание, такой, как реакция стресса.

В связи с этим весьма ответственным моментом в энзимодиагностике является правильный выбор ферментативного теста или комплекса того, что и как определять. В большинстве случаев клиницисты используют в энзимодиагностике комплекс прямых и косвенных методов исследования ферментов. Иногда появление в крови фермента, в норме в ней отсутствующего, позволяет сразу обнаружить поврежденный орган. Это возможно в том случае, когда фермент присутствует только в одном органе. Например, орнитинкарбомоилтрансфераза найдена только в печени. Однако таких высокоорганоспецифичных ферментов очень мало. Несколько больше ферментов, обнаруженных в двух органах или тканях. Большинство же ферментов широко распространены в организме, что затрудняет выяснение источника их происхождения.

Следует отметить, что из огромного числа ферментов (более 3500), открытых в природе (частично и в организме человека), в диагностической энзимологии используется лишь ограниченный набор ферментов и для весьма небольшого числа болезней (гепатиты, инфаркт миокарда, органические поражения почек, поджелудочной железы, печени и др.). Так, уровень липазы, амилазы, трипсина и химотрипсина в крови резко увеличен при сахарном диабете, злокачественных поражениях поджелудочной железы, болезнях печени и др. Резко повышается в сыворотке крови уровень двух аминотрансфераз, креатинкиназы (и ее изоферментов) и лактатдегидрогеназы (и ее изоферментов) при инфаркте миокарда; умеренно повышено их содержание при поражениях тканей мозга и печени. Определяют, кроме того, активность кислой фосфатазы (уровень повышен при карциноме предстательной железы), щелочной фосфатазы, холинэстеразы и других органоспецифических ферментов (например, гистидазы, глицинамидинотрансферазы, уроканиназы) в сыворотке крови при патологии костной

6

ткани, печени, метастатических карциномах и т. д. Доказано, что органы и ткани человека характеризуются специфическим ферментным и изоферментным спектром, подверженным не только индивидуальным, но и суточным колебаниям. Существует большой градиент концентрации ферментов между внутриклеточными и внеклеточными компартментами. Поэтому любые, даже незначительные, повреждения клеток (иногда функциональные расстройства) приводят к выделению ферментов во внеклеточное пространство, откуда они поступают в кровь. Механизм гиперферментации (повышенное содержание ферментов в крови) до конца не расшифрован. Повышение уровня внутриклеточных ферментов в плазме крови прямо зависит от природы повреждающего воздействия, времени действия и степени повреждения биомембран клеток и субклеточных структур органов. В оценке ферментных тестов для диагностических целей особое значение имеет знание периода полужизни (полураспада) в плазме крови каждого из диагностических ферментов, что делает важным выбор точного времени для ферментного анализа крови. Весьма существенным является также знание особенностей распределения (топографии) ферментов в индивидуальных органах и тканях, а также их внутриклеточной локализации.

В последнее время стали применять ферменты рестрикции – специфические эндонуклеазы, катализирующие разрывы межнуклеотидных связей ДНК, для диагностики фенилкетонурии, α- и β-талассемии и других наследственных болезней человека. Метод основан на полиморфизме рестрикционных фрагментов ДНК.

Из представленных данных следует, что диагностическая энзимология может служить основой не только для постановки правильного и своевременного диагноза болезни, но и для проверки эффективности применяемого метода лечения.

Дальнейшее развитие диагностической энзимологии преимущественно идет по двум перспективным направлениям медицинской энзимологии: по пути упрощения и рациональной модификации уже испытанных методов и по пути поиска новых органоспецифических (тканеспецифических) ферментов и изоферментов.

Третье направление медицинской энзимологии – энзимотерапия, т.е. использование ферментов и модуляторов (активаторов и ингибиторов) действия ферментов в качестве лекарственных средств, имеет пока небольшую историю. До сих пор работы в этом направлении почти не выходят за рамки эксперимента за некоторым исключением.

7

ФЕРМЕНТАТИВНАЯ АКТИВНОСТЬ СЫВОРОТКИ КРОВИ

Энзимы сыворотки принято делить на 3 группы:

1.Клеточные ферменты поступают в кровь из органов и тканей. Уровень их сывороточной активности зависит от содержания энзимов в тканях, молекулярной массы, внутриклеточной локализации, прочности связи фермента со своей органеллой, а также от скорости гидролитического расщепления и элиминации. Клеточные ферменты принято делить на

неспецифические и органоспецифические. Активность первых обнаружива-

ется во всех органах и тканях, поэтому по увеличению их сывороточной активности трудно судить о локализации первичных патологических изменений; вторые находятся в одном-двух органах – это наиболее информативные энзимы, т.к. увеличение их активности свидетельствует о поражении этих органов.

2.Секреторные ферменты синтезируются клетками, поступают в кровь и выполняют специфические функции в кровяном русле, поэтому их называют собственно ферментами крови. Это ферменты свертывающей системы и фибринолиза, каллекриин-кининовой системы, холинэстераза и др.

3.Экскреторные ферменты образуются пищеварительными железами и из их секретов поступают в кровь (амилаза, липаза и др.).

Процессы синтеза, функционирования и распада ферментов идут непрерывно и одновременно и обеспечивают определенный уровень их активности в тканях. Большинство ферментов сыворотки крови первично синтезируются в клетках, где их концентрация существенно выше, чем в сыворотке. В кровоток ферменты попадают в результате повреждений клеток или их мембран, естественной гибели клеток, часть ферментов активно секретируются в систему циркуляции. При повышенной гибели клеток увеличивается содержание и соответственно активность ферментов в системе циркуляции. Помимо усиленной гибели клеток повышение активности ферментов в сыворотке крови может быть обусловлено:

– повышенной пролиферацией клеток с ускорением клеточного цикла (опухолевый рост);

– повышенным синтезом ферментов;

– обструкцией путей секреции ферментов в полости;

– снижением клиренса1.

Поскольку ферменты локализуются в различных клеточных компартментах, таких как цитозоль, лизосомы, клеточная мембрана или митохондрии, то появление определенной группы ферментов может свидетельствовать о степени и тяжести повреждения клеток.

1 Клиренс – скорость очищения плазмы крови, других сред или тканей организма от какого-либо вещества в процессе его биотрансформации, перераспределения в организме и/или выделения из организма.

8

Например, такие ферменты, как кислая фосфатаза, 5’-нуклеотидаза, гамма-глутамилтрансфераза (ГГТ), локализованы в клеточной мембране. Аланинаминотрансфераза (АлАТ), аспартатаминотрансфераза (АсАТ), лактатдегидрогеназа (ЛДГ), креатинкиназа (КК) находятся в цитоплазме. АсАТ и КК обнаружены также и в митохондриях. Здесь же находятся такие ферменты, как уроканиназа, глутаматдегидрогеназа (ГДГ). Щелочная фосфатаза (ЩФ) локализована в лизосомах.

Снижение активности ферментов по сравнению с нормальными значениями может быть при сниженном синтезе, врожденных дефицитах, в присутствии ингибиторов активности фермента, при агрегации молекул ферментов.

О механизмах удаления ферментов из системы циркуляции или ингибирования их активности известно мало. Большинство ферментов, повидимому, катаболизируется плазменными протеазами и удаляется ретикулоэндотелиальной системой. Часть ферментов выделяется со слюной, желчью и другими секреторными жидкостями. Через почечный фильтр небольшие молекулы с молекулярной массой не более 60–70 кДа, поэтому в норме количество экскретируемых ферментов невелико. К ним относятся амилаза, которая фильтруется в клубочках почек. Активность амилазы в сыворотке повышается при острой почечной недостаточности, для других ферментов практически неизвестны ситуации, при которых менялся бы их клиренс, т.е. скорость удаления из крови.

ЗНАЧЕНИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ФЕРМЕНТНЫХ КОНСТЕЛЛЯЦИЙ. УЧЕТ ОСОБЕННОСТЕЙ БИОСИСТЕМ ПРИ ЭНЗИМОДИАГНОСТИКЕ

В последнее время особое внимание уделяется исследованию не отдельных ферментативных реакций, а их сочетаний в комплексах (так называемых констелляционных типов), которые наиболее информативно отражают существо тех или иных патобиохимических нарушений. В настоящее время такие ферментативные констелляции систематизированы для различных видов патологии печени, мышечной ткани, воспалительных процессов, злокачественных новообразований и т. д. В результате комплексных исследований можно говорить об определенных биохимических синдромах, характеризующих отдельные заболевания, и о надежности лабораторных методов, помогающих врачу в объективной оценке патологии.

Для уточнения диагноза желательно определение изоферментного спектра того или иного фермента, выявление изменения функционирования пато- и органоспецифичных изоферментов, а также сопоставление активности обнаруженных в крови ферментов с их активностью в органах и тканях в норме.

9

При оценке функции печени все ферменты сыворотки можно разделить на универсально распространенные энзимы, органоспецифичные ферменты и экскреторные ферменты. К 1-й группе ферментов относятся трансаминазы и фруктозо-1,6-бисфосфатальдолаза. Во 2-ю органоспецифических ферментов может быть отнесен комплекс энзимов: фруктозо-1-фосфатальдолаза, орнитинкарбомоилтрансфераза, сорбитдегидрогеназа, уроканиназа. К 3-й группе экскреторных ферментов можно отнести щелочную фосфатазу, β- глюкуронидазу и некоторые др. При различных формах поражения печени могут быть выделены характерные изменения ферментного профиля сыворотки; сочетание различных проб может помочь дифференцировать вирусный гепатит от токсического, разграничить различные виды желтух, уточнить причину, остроту, тяжесть и прогноз болезни. Следует подчеркнуть, что особое значение в трактовке биохимических тестов приобретают сопоставления их с особенностями клиники.

Внекоторых случаях при энзимодиагностике для суждения об активности фермента не обязательно непосредственное его исследование, а можно ограничиться определением легко доступных метаболитов в крови

имоче, изменение которых может отражать функцию той или иной ферментной системы. При этом необходимо знание механизма действия ферментов, его регуляции и взаимосвязи ферментативных процессов.

Необходимо помнить, что при трактовке данных энзимодиагностики рекомендуется учитывать особенности функционирования биокаталитических систем, среди которых особое значение имеет биологическая индивидуальность. В настоящее время четко показано, что здоровым людям присущ генетически обусловленный полиморфизм белкового спектра, не связанный с развитием каких-либо патологических состояний. Такой полиморфизм обнаружен и в отношении ферментов. Вероятно, в будущем станет возможным объединение людей в группы в зависимости от особенностей генетического полиморфизма, характеризующегося различными ферментными профилями. При оценке результатов энзимодиагностики необходимо учитывать также суточные колебания ферментативной активности

идругие биоритмы. Наличие таких колебаний с большим размахом от среднего значения доказано экспериментально. Наконец, следует помнить о важнейшей особенности живого организма – адаптации. Изменение активности фермента может быть вызвано качеством и количеством питания или приемом определенных фармакологических средств, которые могут выступать в качестве индуктора ферментсинтезирующей системы (или, наоборот, ингибировать ее отдельные звенья). Хорошо известно, что почти любое лекарство оказывает влияние на состояние ферментных систем, и это часто является решающим фактором в клиническом эффекте действия лекарственных веществ.

Вклинико-диагностических лабораториях (КДЛ) измерения активности ферментов обычно проводят в сыворотке крови, но ферменты можно

10