Vntr- пцр – фариабельность количества повторов.

У бактерий сущетв тандемные повторы и когда идет репликация, тое уменьшится или увел кол-во тандемн повторов. Берем праймеры к фланкир областям и амплифиц фрагмент содерж повтор. Тот у кого повторов 4, длина фрагм 4Х.

ОТ-ПЦР – используется 1 прймер, используются субстраты, спец буфер, ревертаза синтезирует молекулы ДНК. РНК-аза Н. к 3 штрих концу –реперс праймер.

Выявляют вирусы получают дНк копии. Тжик в центре молекулы Днк. Медо для определения 3 – 3 штрих рейс. Для 5-аналогично. Используют адаптер и полиТпраймер. Получается к ДНК и ставится ПЦР – ставится с прямого праймера или праймера из двух частей. Получаем полАхвост. Полиаденелирование-расщепление матричных ДНК. Некоторые ДНК полиурегинирируются.

ПолиАполимераза может присоединять любые нуклеотиды.

Рибосомные РНК не имеют модификации на конце, что хар-но для большинства РНК.

5-RACE

Доводим до 5, кДНК обрабатывают, можифицируют, на 3 насаживают необходимые нуклеотиды. И образуется полиС-фрагмент. Димеры праймеры образуются, а не ДНК, которую необходимо отделить. Выделяем из геля то, что нас интересует, выделяем и ставим на ПЦР. Есть набор специальный набор отделения кДнк.

Метод определения нуклеотидной последовательность по Сенгеру.

Идет нарастание цепей, наращиваем только 1 цепь. Берем 1 праймер. Необходимо ограничить эти цепи. Использовались дидезоксинуклеотиды. Восстановлены оба гидроксила. Можно взять 4 типа дидезоксинуклеотида. Замешиваем ПЦР с 1 меченым рпаймером. Разделяем на 4 части. В 1 дидезокси А,В,С,Д. обчыно ДДОН чтобы соотношение было 10\1 – но у каждой фирмы сове соотношение. В результате будет набор амплифиц форагменто, оргвнис праймером, с другой гуанином. И наносим на гель GACT. И читаем последовательность. Использ специфческий гель – толщ 0,2 мм. Это позволяет разделять фрагменты, различающиеся на 1 нуклеотид.

Можно разогнать на стеклах – до 50 см. до 40 читабельно. С 1 автографа можно прочитать от 30-80(100).

Автоматизация пришла с внесением флюорисцент метки, вносимая в дидезоксинуклеотид. Аденин светися зеленым, гуанин фиолетовым, тимин-красным, цитозин-синий. Метод очень удобный. Получить заведомо до 600нуклеотидов.

-определение функций различных структур генома.

Позволяющие какие транс –элементы взаимодействют с цис элементами ()

Схема определения промоторов в митох кинетопластид.

1-консервативная, 2 –вариабельная (большое кол-во повторов)

2 праймера, присоед к возможно промотору, клонировала его в плазмиду, взяла праймер к промотеру, а 2 праймер в плазмиде. Амплифицировала весь промотре и участок плазмидной ДНК. Участок плазм ДНК- маркерный ген – транформирован в митохондрию. Синтезировали РНк и выделиле суммарную РНК. Поставили суммарную транскрипцию к бактериальной плазмиде.

РНк- будет давать обратнуб транскирипцию, след образовался ПЦР продукт, значит в исследуемом районе есть промотор. 12 нуклеотидов идентифицировали. Выбирая все меньше и меньше размер конс области.

Гетеро хроматизация. Исследуемая кострук вводит с пом-ю р эл-ов. Если произошло исчезновения функции, значит работает.

Группа методов, которые определяет тран-элементы: фут принт: меод задержки в геле и метод собственно фут принта.

Методом задержки получают комплекс исследуемой ДНк, метят его и смешивают с белком, часть ДНК оразует комплекс с белком. Наносим смесь на гель, так которая с белком движется медленнее. Свободная ДНК убегает значительно дальше. Комплекс ДНК белок сшивается – уф излучение. Обрабатываем нуклеазой, где произошша сшивка разрезать невозмонжо. Наносим на фарез. Наносят фрагмен, в которм определяют последовательность ГАТС.

Метод микрофарез – нанесение на гель в малых количествах и идентиф в малых количествах.

Опрееление через гибридизацию. Наосится на поверхность какой-то структуры набор различных зондов и в ним присоеденияется меченая молекула ДНК, но она связанная с гасителем. Когда происходит взаимод гаситеьл теряет связь с меткой и метка начинает светится. На 1 планшете можно определить большое кол-ко что где отжигается.

Идетификация белков – мпетод чипов.

Позволяет сренировать больие объемы за достаточно быстрое время.

Структура геномов прокариот.

Геном прокариот делится на хромосомный и нехромосомный. Основной геном хромосомный, образован хромосомой или нуклеоидом.

Бектериальная хромосома неограниченна мембраной, прикреплена к цитоплазматической мембране клетки. Всегда кольцевая и содержит основной набор генетической инормации для функционирования клетки. Длина генома 8*10в6 пн. Чем более бактерия самостоятельна тем длиннее ее геном. Геном паразитических бактерий короче, чем бактерий, которые ведут паразиический и сапрофитный образ жизни. У бактерий экстрималов значительно длиннее. ГС состав тоже достаточно сильно варьирует в предела 30-40 %. Между дальнородственными видами – как таксономич признак. Хромосомная ДНК содержит 1 точку репликации транскрип. Счит, что бактер кл гаплоидна. ДНК упорядочена, связана с белками. Саму структуру геном можно пдразделить на 2 части – кодирующая и некодир. Кодир ДНК составляет до 95%, в кодир ДНК входят открытые рамки считывания - от старт до стоп кодона, часть которая транслируется. В случае транспортных и рибосомных рнк – функцион часть от 1 до 2. Гены не перекрваются. Геном прокариот не имеет перекрываний и компактность не выходит далко. Некодирующей ДНК относится все остальное – но это функциональные элементы – ориджинрепликации. Состоит из не-ких инвертируемых и тандемных повторов. Очень АТ богатая, связываются белки инициации репликации. Регуляторный элементы транскрипции – открытая рамка считывания входит в состав транскриптон – промотор, регуляторн элементы, открыт рамка счит(несколько, которые кодируют белки одного метаболитического пути - оперон), терминатор. Оперонная организация генома. К регуляторным элементам транс – операт пром, регул термин.

Структура промотора – у эукариот четкая струткура не выявляется. Длина 80поснований. 1 точка инициации А/Г, 2 участка, распознающ ДНК –полимеразой. -10 домен прибного ТАТААТ от 5-9 пн, домен -35 ТТГАСА – высокий уровеньблока ТТГ. Расстояние между -9-36 16-19 п.н.

Сила промотера – частота инициации, частота перехода в открытый или закрытый комплекс. Самым сильным промтоер- консенсусный. Любое отклонению по структуре идет к ослаблению промотера. Для риб и транс сильные промотеры РНК. Регуляция процесса основана на наличии сильных и слабых промоторах.

Регуляция лактозного оперона.