ВСТУП

В наш час біотехнологія набуває все більшого поширення як галузь науки, тому пошук нових технологій виробництв певних продуктів мікробного синтезу, обладнання промисловості, а також вдосконалення вже існуючого устаткування є одними з найпріоритетніших напрямків роботи.

Темою даного курсового проекту є виробництво пропіонової кислоти, відділення отримання посівного матеріалу та саме виробничий біосинтез в біореакторі з механічним перемішуванням.

Пропіо́нова кислота (також пропанова кислота, метилоцтова кислота, консервант E280; від грец. προτος — «перший», πιον — «жир») — їдка рідина без кольору з різким запахом, з хімічною формулою — С₂Н₅-СООН. У природі пропіонова кислота зустрічається у нафті, також може утворюватись внаслідок ферментації (пропіоновокисле бродіння). Бактерії роду Propionibacterium виробляють пропіонову кислоту, як кінцевий продукт свого анаеробного метаболізму. Ці бактерії часто зустрічаються в шлунку жуйних тварин. У промисловості її отримують окисленням вуглеводнів C₄—C₁₀ або пропіонового альдегіду, а також введенням карбонільної групи у молекулу етилену.

Кислоту та її похідні застосовують у виробництві гербіцидів (пропанол), лікарських речовин (ібупрофен), ароматичних речовин, розчинників (бутилпропіонату), поверхнево-активних речовин. Завдяки здатності стримувати розвиток бактерій та плісняви найчастіше її застосовують як консервант у продуктах для людини та тварин. У продуктах, споживаних людьми, особливо в хлібі і в інших хлібобулочних виробах, пропіонова кислота використовується як натрієва (пропіонат натрію) або кальцієва (пропіонат кальцію) солі.

Саме завдяки основним сферам застосування, фармацевтичній та харчовій, важливими є шляхи вдосконалення методів отримання цільової пропіонової кислоти та основного обладнання, що використовується при виробництві. В проектуванні біотехнологічних виробництв важливе значення має апаратурне оформлення технологічних процесів. Обладнання має багато спільного із обладнанням галузей хімічної та харчової промисловості. Найбільш відомими апаратами є змішувачі, випарні установки, теплообмінники, ферментери та ін.

Ферментери набули широкого розповсюдження в біотехнологічній, хімічній та інших галузях промисловості. Основним процесом, що проходить у даних апаратах є ферментація. Під ферментацією розуміють всю сукупність послідовних операцій від внесення в заздалегідь приготовлене і нагріте до необхідної температури середовище посівного матеріалу і до завершення процесу росту клітин або біосинтезу цільового продукту. По закінченні ферментації утворюється складна суміш, що називають культуральною рідиною.

Для синтезу цільового продукту – пропіонової кислоти, необхідно дотримуватись заздалегідь встановлених та визначених параметрів культивування та стандартів.

1. Викладення технологічного процесу

Відомо кілька способів отримання глутамінової кислоти: гідроліз різних білків, хімічний синтез, ферментативний синтез з α-кетоглутарової кислоти і мікробіологічний синтез.

Гідроліз протеїнів є класичним методом отримання амінокислот з природних джерел. Для вироблення глутамінової кислоти та її натрієвої солі використовуються тваринні і рослинні білки: казеїн молока, клейковина пшениці, кукурудзяний глютеїн, відходи м'ясокомбінатів, бурякоцукрових (сепараційні луги) і спиртових заводів (барда).

Метод гідролізу малопродуктивний і досить дорогий через значне утворення побічних продуктів і необхідності ретельного очищення глутамінової кислоти.

Комплексна переробка меляси дозволяє отримати поряд з високоякісними цукровими сиропами глутамінової кислоти, бетаїн, холін та інші цінні продукти.

Серед методів хімічного синтезу найбільш перспективним є використання в якості вихідної сировини акрилонітрилу. Відповідно до цього методу акрилонітрил в результаті реакції гідроформілювання перетворюється в β-формілпропіоннітрил і останній через стадію утворення α-аміноглутардинітрила перетворюються в DL-глутамінову кислоти.

Основним недоліком хімічного синтезу є отримання рацематів амінокислот. Поділ D-і L-ізомерів є досить складною операцією і вимагає великих витрат.

Ферментативний синтез глутамінової кислоти здійснюють з α-кетоглутарової кислоти за допомогою ферментів трансамілази або глутаматдегідрогенази в результаті наступних перетворень. У кожному з цих процесів α-кетоглутарова кислота відіграє роль попередника. Для здійснення будь-якого з цих перетворень необхідні джерела α-кетоглутарової кислоти і відповідної ферментної системи. Перше з цих завдань вирішують за допомогою підбору мікроорганізмів, здатних продукувати значну кількість α-кетоглутарової кислоти з доступних джерел сировини. Продуцентами α-кетоглутарової кислоти можуть бути Psedomonas і Esherichia, а при культивуванні продуцента Kluyverd citrophila α-кетоглутарова кислота була отримана з 57%-вим виходом. Дріжджі роду Candida при вирощуванні на н-парафінах продукують α-кетоглутарову кислоту спільно з піровиноградною в співвідношенні 6:1. Економічний коефіцієнт процесу біосинтезу досягає 90% від кількості спожитих вуглеводнів.

У ролі продуцента ферменту трансамідази можуть виступати різні мікроорганізми, наприклад Е. coll. Донором аміногруп може бути аспарагінова кислота або аланін. Відновне амінування можливо здійснити за допомогою Pseudomonas (при використанні Ps. Ovalis вихід L-глутамінової кислоти становить 60%) або Aeromonas, причому деякі штами цих мікроорганізмів в якості субстрату можуть використовувати D, L,-α-оксіглутарову кислоту, вироблену хімічним синтезом.

Найбільш перспективним і широко використовуваним способом виробництва глутамінової кислоти є мікробіологічний синтез. Вперше про можливість отримання L-глутамінової кислоти безпосередньо з вуглеводів за допомогою мікроорганізмів методом глибинного культивування повідомили в 1957 р. японські вчені Кіносіта, Асаї.

До теперішнього часу з'ясовано, що здатністю продукувати глутамінову кислоту володіють деякі раси дріжджів, мікроскопічні гриби, бактерії. Однак практично лише бактерії можуть синтезувати глютамінову кислоту з виходом не менше 40% щодо вихідного цукру або іншої сировини. Тому промислове значення мають поки тільки бактерії, що відносяться до родів Micrococcus, Brevibacterium, Microbacterium, Corynebacterium.

Для здійснення процесу біосинтезу глутамінової кислоти з високим виходом використовують мутанти з порушеною ферментативною системою перетворення α-кетоглутарової кислоти в бурштинову.

Склад живильного середовища для головної ферментації і для отримання посівного матеріалу в значній мірі залежить від використовуваного продуцента, від його фізіологічних особливостей. Основним джерелом вуглецю в середовищі найчастіше є глюкоза, сахароза, гідролізати крохмалю, бурякова меляса, гідрол. Кількість засвоюваного цукру в перерахунку на сахарозу повинно бути в межах від 8,5 до 25%. Але слід пам’ятати, що межі використання меляси визначаються рівнем в ній біотину. Концентрація біотину, за даними більшості дослідників, не повинна перевищувати 2-5 мкг на 1 л поживного середовища, інакше замість глутамінової кислоти будуть інтенсивно накопичуватися аланін, молочна, янтарна, аспарагінова кислоти, різко зросте приріст біомаси продуцента, але знизиться вихід глутамінової кислоти. Крім меляси біотин в середу може бути внесений із кукурудзяним екстрактом.

Інгібуючий вплив біотину вдається знизити при включенні до складу поживних середовищ різних добавок у вигляді деяких спиртів, ПАР, антибіотиків (тетрациклінів). Ймовірно, це пов’язано зі зміною ліпідного складу клітинних мембран, що сприяє збільшенню проникності клітинних мембран для глутамінової кислоти. Присутність такого роду стимуляторів дозволяє вести ферментацію з великим виходом глутамінової кислоти при підвищених концентраціях біотину. Добавки в середу ПАР в кількості 0,01-0,2% або калієвої солі бензилпеніциліну підвищують біосинтетичну здатність продуцента на 15-45% і вихід глутамінової кислоти досягає 50г / л.

Як джерело азоту в поживних середовищах найчастіше використовують сечовину в кількості до 1,5-2,0% в залежності від особливостей використовуваного штаму, але вводиться вона дробно, по мірі споживання її з середовища, і так, щоб вміст її в культуральній рідини не перевищувало 0,8% і рН середовища було в межах від 6,8 до 7,8. Брак азоту в середовищі призводить до зниження синтезу глутамінової кислоти і до накопичення в середовищі підвищених кількостей α-кетоглутарової кислоти.

Для нормального росту культури і синтезу нею глутамінової кислоти необхідно вводити в середу солі калію у вигляді КН₂РО₄.

Принципова технологічна схема одержання глутамінової кислоти або глутамату натрію складається з наступних стадій: отримання посівного матеріалу; очистка повітря для проведення аеробного процесу, приготування живильного середовища, його стерилізація, охолодження і засів готовим посівним матеріалом; вирощування продуцента в ферментаторі до накопичення максимальної кількості глутамінової кислоти; виділення глутамінової кислоти в кристалічному вигляді або у вигляді кристалів глутамату натрію, сушка кристалів, фасовка і упаковка [2].

Докладніше стадії технологічного процесу будуть розглянуті в розділі: «Призначення та галузь використання виробу, що розробляється»

2. Призначення та галузь використання виробу, що розробляється

Принципова технологічна схема одержання глутамінової кислоти при культивуванні Corynebacterium gtutamicum складається з таких стадій:

ДР 1. Санітарна підготовка виробництва

ДР 1.1 Підготовка персоналу

Підготовка персоналу полягає у санітарно-медичному обстеженні, навчанні персоналу, підготовці працівників до роботи в різних типах приміщень і лабораторій, цехів (приміщень різних класів чистоти).

ДР 1.2 Підготовка обладнання та комунікацій

ДР 1.2.1 Мийка обладнання

Ферментер (посівний апарат) звільняють від залишків попередньої операції (наливається вода 10-20 % від об’єму, включається мішалка, при необхідності підігрівають, перемішують на протязі 0,5-1 годин). На другому етапі ферментер миють з миючими засобами (NaOH до 5 % наливають 20-40 % по об’єму і перемішують 30 хв.). Далі промивка апарату до нейтралізації рН (один чи два рази з мішалкою 15-20 хв).

ДР 1.2.1 Огляд обладнання

Надалі ззовні та всередині оглядають апарат (штуцера, ущільнення, вентилі, фланцеві з’єднання, датчики і т. Д.). Ферментер герметично закривають та перевіряють на герметичність.

ДР 1.2.3 Стерилізація обладнання

Термічним способом: подача перегрітої насиченої пари всередину апарату під тиском (гостра пара) під тиском 2 атм, тривалістю 1,5 год, з температурою 100-140 ⁰С.

ДР 1.3 Підготовка робочих та миючих розчинів

Підготовка миючих розчинів полягає у змішуванні дезінфікуючих засобів з водою для отримання концентрації, необхідної для мийки обладнання, підлоги, стін, столів.

ДР 1.4 Підготовка приміщень

На цій стадії проводиться мийка підлоги, стін, поверхонь, обробка УФ лампами. В лабораторіях проводиться кожен день мийка підлоги з миючими та дезінфікуючими засобами, столи протирають з дезінфікуючими засобами (наприклад, перекис водню), 1-2 рази обробка УФ лампами всього приміщення або робочого місця. Мікробіологічний бокс – мийка поверхонь кожний день, раз на тиждень мийка більш агресивними розчинами. Цех – мийка 1-2 рази на місяць. Після мийки руки дезінфікують з додаванням пом’якшуючих засобів.

ДР 2. Приготування поживного середовища для культивування продуцентів глутамінової кислоти.

Для промислових штамів Corynebacterium gtutamicum поживні середовища при виробництві посівного матеріалу, як правило, містять наступні компоненти (в%):

Компонент поживного середовища	%
Меляса	8
Кукурудзяний екстракт	0,3
Хлорид амонія	0,5
Калія фосфат двозаміщений	0,05
Сульфат магнію	0,03
Вода	залишок
рН середи	7,0-7,2

Тому приготування поживного середовища для культивування продуцентів глутамінової кислоти здійснюється у дві стадії.

ДР 2.1 Приготування та стерилізація розчину меляси.

Бурякова меляса, яка використовується у виробництві глутамінової кислоти, містить термолабільний компонент – сахарозу. Тому її стерилізують окремо. У реактор, забезпечений мішалкою – змішувач, подають мелясу і нагрівають її при постійному розмішуванні до температури 80°С, змішуючи її з водою, згідно з наявною рецептурою, потім її швидко розігрівають глухою парою до температури 120-122°С, у спеціальному апараті, і витримують при цій температурі певний час, необхідний для повної загибелі всієї мікрофлори.

ДР 2.2 Приготування та стерилізація розчину поживних солей та кукурудзяного екстракту.

Поживні солі і всі інші компоненти середовища розчиняються в змішувачі, але з таким розрахунком, щоб при наступному поєднанні цих розчинів вийшли прийняті регламентом концентрації компонентів у середовищі. Потім приготовані суміші надходять у нагрівальну колонку і нагрівають при температурі 135 °С гострою парою під тиском р=0,1 МПа, потім передають у витримувач – тривалість витримування 1 година.

ДР 2.3 Змішування компонентів поживного середовища

Простерилізована меляса та розчини поживних солей і кукурудзяного екстракта поступають у реактор-змішувач, де вони гомогенізуються і перемішуються на протязі 30 хв.

ДР 2.4 Охолодження поживного середовища

Після змішування поживне середовище поступає на теплообміник типу «труба в трубі», де проходе охолодження середовища до температури культивування Corynebacterium gtutamicum, тобто до 29-30 °С за допомогою теплоносія – води.

ДР 3 Підготовка стерильного повітря

Для здійснення культивування продуцента у посівному апараті, і в ферментері необхідне стерильне повітря. Для цього використовується ціла система фільтрів і кондиціонерів.

Очищення припливного повітря для приміщень С і D класів чистоти двохступеневе, для приміщень В, А класу чистоти — трьохступеневе.

ДР 3.1 Забір повітря з атмосфери

Повітря, яке забирається з атмосфери проходить через трубу повітрозбірника і для попереднього очищення подається на фільтр попередньої очистки.

ДР 3.2 Попереднє очищення повітря

На першому етапі повітря проходить очищення на фільтрі, що заряджений тканиною ФРНК-ПГ (продуктивність – 1540 м/год, площа робочого перерізу – 0,22 м.). Заміну тканин проводять за перепаду тиску більше, ніж 45 мм. вод. ст. за показником рідинного манометра.

ДР 3.3 Стиснення повітря

Повітря забирається з атмосфери, очищається від грубих часток у фільтрі і надходить у турбокомпресор, де відбувається його стиснення, температура повітря піднімається до 150 – 160 °С.

ДР 3.4 Охолодження повітря

Повітря охолоджується на кожухотрубчастому теплообміннику, відокремлюється конденсат і далі повітря подається в ресивер, що забезпечує рівномірність подачі повітря в ферментатор.

ДР 3.5 Стерилізація повітря другого ступеня

Підготовлене таким чином повітря надходить до заповненого активованим вугіллям і скловатою головного фільтра. Повітря проходить очищення на фільтрах типу НЕРА з ефективністю очищення 95%.

ДР 3.6 Стерилізація повітря третього ступеня

На третій ступені повітря проходить фінішну стерилізацію на фільтрах типу НЕРА з ефективністю фільтрації 99,9999%, встановлених безпосередньо на вході повітря в приміщення В, А класів чистоти.

Повітря, яке відходить з ферментатора, перед викидом в атмосферу знову очищається від клітин самого продуцента на повітряних фільтрах для того, щоб не забруднювати довкілля, і повертається в систему очистки повітря.

ДР 4 Приготування вихідної та посівної культури

Посівний матеріал на кожній із стадії його отримання (від пробірок до посівного апарату) вирощують в строго асептичних умовах по 24 годин Склад поживних середовищ незначно змінюється при переході від одного продуценту до іншого і практично залишається постійним на кожній з проміжних стадій отримання посівного матеріалу. Тільки при вирощуванні продуцента в посівному апараті в живильне середовище вносять до 0,1% стерильного синтетичного піногасника.

ДР 4.1 Відновлення музейної культури на пробірках

Вільну від фага і сторонньої мікрофлори вихідну культу продуцента з чашки Петрі з агаром Хоттінгера пересівають в пробірки з 2%-ним м׳ясопептнним агаром і вирощується протягом доби при температурі 29-30 °С.

ДР 3.2 Відновлення музейної культури в колбах

На основі культури, отриманої в пробірках готують на стерильній водопровідній воді суспензію густиною 108 клітин на 1 мл. Цією суспензією засівають стерильне живильне середовище в качалочних колбах. Посівні колби вирощуються на гойдалках добу при температурі 30 °С.

ДР 3.3 Нарощування продуцента в посівному апараті

В посівний апарат на 250 л вносять 5-6% від об’єму середи посівного матеріалу Corynebacterium gtutamicum, напрацьованого на колбах. Коефіцієнт заповнення посівного апарату складає 0,5. Культуру вирощують при температурі 29-30 °С, неперервному доступу повітря ( 1 об׳єм повітря на 1 об׳єм середи за хвилину) і перемішуванні-мішалкою турбінного типу на протязі 24 годин [3].

ТП 4 Виробничий біосинтез

Процес біосинтезу здійснюють в строго асептичних умовах в ферментаторах об’ємом 50 м³ з коефіцієнтом заповнення апарату 0,7 Посівний матеріал в кількості 5-10 об. % від обсягу живильного середовища надходить у ферментатор. Відразу після засіву в нього подається повітря, нагріте до 50 °С, з розрахунку 1 об’єм повітря на 1 об’єм живильного середовища за хвилину при тиску 0,12-0,13 Мпа.

Тривалість ферментації становить 55-72 год, процес проводять при інтенсивному перемішуванні середовища, температурі 28-32 °С, рН = 7,0 −7, 5 (підтримується додаванням в середу аміачної води) і періодичною подачею стерильного піногасника.

Процес культивування складається з двох стадій. У першу добу клітини споживають близько 25% вуглеводів і азотистих речовин, у цей час накопичується майже вся біомаса. На другій стадії швидкість накопичення біомаси різко знижується, але в культуральній рідині відбувається накопичення лізину. Температуру культивування на всіх стадіях підтримують постійною на рівні 28-30 °С. В кінці процесу біосинтезу готова культуральна рідина містить до 45 г/ л глутамінової кислоти. Вихід глутамінової кислоти по відношенню до споживання цукру становить 45-50%.

Оскільки виробництво глутамінової кислоти спрямоване на одержання високоочищених препаратів, подальша технологічна схема передбачає виробництво продуктів, підготовлених безпосередньо до застосування в якості харчових добавок і у вигляді лікарських форм.

Виділення глутамінової кислоти з культуральної рідини і подальша очистка її відповідно до вимог фармакопеї припускає таку послідовність проведення технологічних операцій.

ТП 5 Попередня обробка культуральної рідини

Здійснюється в результаті додавань до неї певної кількості негашеного вапна (або вапняного молока) з наступним осадженням надлишку іонів кальцію фосфорною кислотою. Утворений при цьому осад сприяє кращому відділенню клітин продуцента та інших баластних домішок.

ТП 6 Відділення осаду

Проводять центрифугуванням або фільтруванням під тиском

ТП 7 Освітлення фільтрату

Полягає в очищенні його від пігментних домішок, забарвлюючих нативний розчин в темний колір. Для цього обробляють фільтрат активованим вугіллям або піддають його іонообмінної сорбції на аніоніті ІА-1.

ТП 8 Концентрування освітленого розчину глутамінової кислоти

Проводять шляхом його вакуум-випарювання за температури 40-60 ° С, при цьому з вихідного розчину глутамінової кислоти відганяють від 50 до 80% води.

ТП 9 Осадження кристалів глутамінової кислоти в ізоелектричної точці

Ця стадія здійснюється шляхом підкислення отриманого на попередньому етапі концентрату соляною кислотою до рН 3,2 (ізоелектрична точка глутамінової кислоти) і охолодженням розчину до 4-15 °С. Одноразове проведення операції забезпечує кристалізацію 77% глутамінової кислоти; при повторному її проведенні вихід зростає до 87%. Чистота одержуваних кристалів досягає 88%.

В результаті подальшої перекристалізації чистоту кристалів можна збільшити до 99,6%, що задовольняє вимогам фармакопеї.

ТП 10 Відділення кристалів гдутаміновой кислоти від маточника

Це досягається центрифугуванням з наступною декантацією і поверненням маточника на стадію вакуум-випарювання. Отримані кристали промивають знесоленою водою і направляють на сушку.

ТП 11 Сушка кристалів глутамінової кислоти

Проводиться в вакуумі або в течії нагрітого повітря при 60-70 °С.

ТП 12 Отримання глутмата натрію

Процес здійснюється обробкою вологих кристалів перекристалізованої глутамінової кислоти гідроксидом натрію. Для цього вологі кристали розчиняють у визначеній кількості води і нейтралізують 45-50%-ним розчином їдкого натру, рН розчину доводять до 6,8 після чого його фільтрують. Освітлений розчин глутамату натрію випарююють під вакуумом до отримання сухих речовин близько 60% і передають на кристалізацію. Її проводять протягом трьох діб при поступовому зниженні температури. Кристали глутамату натрію відокремлюють від маточного розчину центрифугуванням і сушать в течії гарячого повітря [4].

ЗВ 13 Знешкодження відходів