Лекция 1-Микроскоп

11

Кафедра гистологии Симферопольского

Медицинского университета

Лекция 1

Гистология, ее значение в системе медицинского образования. История развития. Методы исследования.

              Гистология - наука о развитии, строении и жизнедеятельности тканей растительных и животных организмов. Современная гистология изучает структуры организма человека и животных в связи с происходящими в них процессами, раскрывает соотношение между функцией и структурой, изучает взаимосвязь обмена веществ и структурных элемeнтов организма, а также архитектонику микроскопических структур.

          Гистологию делят на три основных раздела.       1. Цитологию - учение о клетке.       2. Общую гистологию - учение о тканях.       3. Частную гистологию - учение о микроскопическом строении органов, их клеточном и тканевом составе.

      С гистологией теснейшим образом связаны ряд биологических и медицинских дисциплин - сравнительная анатомия, биохимия, патологическая анатомия, патологическая физиология, гематология. В программу курса гистологии в медицинских вузах включают общую и частную эмбриологию.

    Гистология теснейшим образом связана с эмбриологией, изучающей процесс индивидуального развития организмов - онтогенез. В определенные периоды развития организмов возникают ткани. Возникновение тканей - процесс, в течение которого эмбриональные закладки превращаются в тканевые структуры, поэтому изучение основных этапов эмбрионального развития должно предшествовать изучению тканей.

   Учение о взаимосвязи структур клеток, тканей и органов с их функцией – гистофизиология . Изучение гистофизиологии клеток и тканей в процессе жизни организма имеет большое значение для решения многих медицинских вопросов.

   Цитохимия и гистохимия  .изучают локализацию различных химических веществ в тонких структурах клеток и тканей, выясняют динамику обменных процессов в клетках и тканях, взаимосвязь между обменом веществ и структурными элементами. Это пример плодотворного развития научных исследований на грани смежных наук - гистологии и биохимии. Вообще нужно отметить, что современные открытия чаще всего осуществляются при сотрудничестве двух-трех, а иногда и большего количества самостоятельных отраслей знаний. Научная работа современного гистолога теснейшим образом связана с успехами физики, химии, математики.

   Таким образом тесное взаимодействие различных отраслей знаний способствует углубленному проникновению ученых в тайны природы. Гистология тесно связана с биологическими и медицинскими науками, занимает важное место в системе медицинского образования, являясь наряду с другими общебиологическими дисциплинами фундаментом, на котором строятся многие теоретические и клинические дисциплины.

Методы микроскопических исследований

     Развитие гистологии теснейшим образом связано с микроскопом, который является основным инструментом исследователя. Каждое новое усовершенствование конструкции микроскопа приводит к расширению и углублению наших знаний в области цитологии, гистологии, гистохимии.

     В настоящее время большинство исследователей считают, что первый микроскоп был создан А. Левенгуком. Прежде, чем говорить о работах Левенгука и вообще о принципах конструкции микроскопа нужно остановиться на особенностях нашего зрения. Человек, не нуждающийся в очках, на расстоянии 25 см от рассматриваемого объекта может различить предмет размером 0,07-0,08 мм. Расстояние между светочувствительными клетками сетчатки не позволяет видеть предмет под углом меньше 1 условной минуты.

      Разрешающая способность микроскопа(минимальное расстояние между двумя точками, которое различает глаз) согласно теории Аббе равна одной трети длины световой волны.

      Абберрация - отклонение. Сферическая абберация - лучи проходят через линзу и преломляются в центре и по краям неодинаково.

      Хроматическая абберация - изображение окружено радужным ореолом т.к. световое излучение, содержащее различные длины волн преломляется линзой неодинаково.

      Первым человеком, преодолевшим эти препятствия и вплотную подошедшим к теоретическому расчету одиночной линзы, был голландский торговец сукном и пристав судебной палаты города Дельтфа Антоний Левенгук. Он сам шлифовал линзы из хрусталя и стекла и добился успеха невероятного даже в наши дни - увеличения в 150-300 раз. После смерти А. Левенгука секрет изготовления линз был утерен и по-видимому навсегда.

       В историю Антоний Левенгук вошел как изобретатель микроскопа, но он довел до совершенства старый метод шлифовки одиночной двояковыпуклой линзы. Он первым увидел инфузории, мужские половые клетки, поперечную исчерченность скелетных мышц, движение эритроцитов по капиллярам.Слава о Левингуке гремела по всей Европе. Петр 1 посетил Левенгука во время путешествия по Западной Европе. Левенгук показал Петру 1 движение эритроцитов в капиллярах молодого угря.

      Настоящего совершенства оптический микроскоп достиг значительно позже - во второй половине ХIХ века, когда физик и математик Эрнст Аббе разработал современную теорию микроскопа, на основе которой механик Карл Цейсс построил первые объективы апохроматы. Хроматическая и сферическая абберация в них появляются только при очень больших увеличениях.

 

Карл Цейсс (1816 - 1888 )

Эрнст Аббе (1840 – 1905 )

      Примерно в тоже время препараты научились окрашивать, и это позволило увидеть тончайшие детали тканей и составляющих их клеток. Не будь окрашивания, мы бы не увидели хромосом (хромосома в переводе означает "окрашивающееся тело").

      Развитие наших знаний о микроскопическом строении органов и тканей углублялось по мере усовершенствования микроскопа.

      Теоретически по расчетам Эрнеста Аббе разрешающая способность микроскопа равняется 1/3 длины световой волны. На практике она соответствует 1/2 длины световой волны.Поэтому обычный оптический микроскоп отказывается работать при разрешающей способности менее 2000 А. Ангстрем (А) - единица длины равная 0,1ммк, или 0,0001мк,или 10^-8 степени сантиметра. В ангстремах измеряются субмикроскопические структуры клеток, открываемые с помощью электронного микроскопа. Название этой единицы длины дано по имени шведского физика Ангстрема (1814- 1874 гг.) А.

      Наш глаз наиболее чувствителен к свету с длиной волны порядка 5000 Следовательно придел разрешения обычного микроскопа 2000-2500 ангстрем. Вывод из данной ситуации напрашивается сам. Можно взять вместо видимого света ультрафиолетовый (длина волны около 2000 А).ультрафиолет поглащается обычным стеклом, но поглащения можно избежать, если сделать линзы из кварца или построить микроскоп на вогнутых зеркалах. Изображение в ультрафиолете проектируется на светящийся экран или фотопластинку.

      УФ лучи, примененные для микроскопических исследований, послужили в принципе основой для широкого развития спектроскопических исследований в цитологии и гистологии, на основе которых развилось очень перспективное направление  - цитоспектрофотометрия.

      Поводом для этого послужило свойство УФ лучей-сильное поглощение важнейшими компонентами клетки - белками и нуклеиновыми кислотами. Поэтому резко возрастает контрастность изображения и отпадает необходимость в окраске препарата, фазовом контрасте и т.д.

       Ультрафиолетовый микроскоп был создан примерно 90 лет назад, но и сейчас применяется во многих областях естествознания. Он дает разрешающую способность до 1200 А.

       В последние годы широко используемая ранее единица измерений Ангстрем (А) применяется редко.

      Линейные единицы измерения, используемые при гистологических исследованиях:

                    1 миллиметр (1 мм) = 10^-3 м = 10³ мкм = 10 ⁶ нм = 10 ⁷ А

                    1 микрометр (1 мкм) = 10 ^{– 6}м = 10^-3мм = 10 ³ нм = 10 ⁴ А

                    1 нанометр (1нм) = 10 ^{– 9} м = 10 ^–6мм = 10 ^{– 3} мкм = 10 А

                    1 ангстрем ( 1 А) = 10 ^–10 м = 10 ^–7 мм = 10 ^{– 4} мкм = 10^-1 нм

     Одним из важнейших достижений гистологической техники второй половины 19 века явилось, связанное с именем выдающегося чешского ученого Яна Пуркинье , создание микротома - прибора, позволяющего резать различные ткани и органы животных и растений на тонкие прозрачные пластинки толщиной несколько микрометров, которые можно рассматривать в микроскопе при увеличении до 2000 раз и более.

Начиная с 70 годов 19 века, применение микротома и введение в гистологическую технику красителей, оказало большое влияние на расширение и углубление наших знаний о микроскопическом строении органов и тканей.

Систематизация полученных знаний привела к созданию классификации тканей животных и человека (Р. Келликер и Ф. Лейдиг).Были выделены четыре основные группы тканей. Это открытие заложило основы учения о тканях.

Ян Пуркинье (1787 – 1869) –чешский естествоиспытатель и общественный деятель;один из основоположников учения о клеточном строении животных и  растений,основатель пражской гистологической школы.Я.Пуркинье – автор многочисленных работ в области физиологии,анатомии,эмбриологии,гистологии;его исследования сыграли важную роль в формировании современной экспериментальной физиологии.

 1.1. Изготовление гистологических препаратов для световой ( А ) и электронной ( Б ) микроскопии.

 

                                                 1.2.  Методы окрашивания гистологических препаратов.

Рудольф Келликер ( 1817 – 1905 ) – немецкий гистолог и эмбриолог ,доктор медицины, профессор анатомии, гистологии и эмбриологии Вюрцбургского ун-та. Предложенное им деление тканей организма на эпителиальную, соединительную (с кровью), нервную и мышечную нашло отражение в современной гистологической классификации. Он одним из первых стал сторонником клеточной теории .

                                                                                                                                                                                                                                       

          Люминесцентный микроскоп. Было замечено, что если осветить препарат ультрафиолетовыми или фиолетовыми лучами сбоку, то многие структуры живых клеток начинают светиться красным, зеленым или желтым цветом. Благодаря этому эффекту впоследствии родилась "люминесцентная микроскопия" широко используемая в современных биологических исследованиях. Для этих исследований используются специальные люминесцентные микроскопы и приставки.

 1.3.  Высокоспецифичная многократная флуоресценция: различные флуорофоры маркируют точно определенные структуры в цитоскелете отдельных клеток

       В последние годы получает широкое распространение метод конфокальной флуоресцентной микроскопии, который открывает интересные перспективы для исследований.

      Этот метод спектроскопирования может проводиться лишь на специальных микроскопах, а именно, посредством конфокальных микроскопов. Следует кратко осветить этот метод, так как он существенно расширяет возможности микроскопии.

      В конфокальной микроскопии ( см.рис. ) параллельный световой пучок (1) отображается объективом (2) на пробу (3). В ходе лучей находятся сканеры (4), с помощью которых луч сканирует пробу (3). Генерируемый на пробе флуоресцентный свет снова возвращается через сканеры, что приводит к нейтрализации и компенсации движения луча, затем отклоняется светоделителем (5) и фокусируется на точечной диафрагме (6). За точечной диафрагмой флуоресцентный свет посредством запирающего фильтра (7) отделяется от света возбуждения и постоянно измеряется световым детектором (8). Из таких замеренных значений компьютер "складывает" электронное изображение. Решающим фактором является то, что через точечную диафрагму (6) в "пространственном фильтре" (А) проходит только флуоресцентный свет из фокальной плоскости объектива (3). Свет от других плоскостей в пробе (например, За) очень эффективно подавляется точечной диафрагмой (6). Это позволяет рассматривать отдельные плоскости пробы. С помощью компьютера создаются трехмерные изображения (3D-images).

1	2                                         3

Рис.1.4.-Ход лучей в конфокальном микроскопе.

Регулярное флуоресцентное изображение (слева,2) пересвечено и не позволяет распознать отдельные детали внутри объекта. Совсем иначе обстоит дело с конфокальным изображением (справа, 3 ), на котором четко видна отдельная плоскость внутри препарата.

         Фазовоконтрастный микроскоп. В основу конструкции фазовоконтрастного микроскопа положена идея, являющаяся простой и очень плодотворной. Глаз человека и фотопластинка не регистрируют изменений фазы световой волны, но хорошо различают изменение ее амплитуды. В фазовоконтрастном микроскопе имеется специальное устройство, которое преобразует сдвиг волн по фазе (такой сдвиг происходит при прохождении света через препарат) в сдвиг по амплитуде хорошо ощущаемый глазом. Благодаря этому преобразованию изображение приобретает контрастность.

      Фазовоконтрастное устройство к биологическому микроскопу (рис.5) состоит из набора фазовых объективов О, отличающихся от обычных наличием кольцеобразной фазовой пластинки П, конденсора К с набором кольцевых диафрагм Д и вспомогательного микроскопа, который увеличивает изображение кольцевой диафрагмы и фазовой пластинки при их совмещении.

                                                                    

                                                          Рис. 1.5. Фазовоконтрастное устройство.

         Микроскопы совершенствовались в разных направлениях. Немалую роль сыграл в этой области русский ученый-химик академик И.В.Гребенщиков.Он открыл новые пористые стекла, обладающие адсорбционными свойствами. Предложил метод обработки оптических деталей- нанесение на стекло тонких прозрачных пленок, снижающих отражение света. Так родилась знаменитая голубая (просветленная) оптика.

       Рентгеноструктурный анализ изучает пространственное строение микроскопических структур с помощью лучей Рентгена. На основании данных этого метода была создана в 1953 году Уотсоном и Криком модель молекулы ДНК. Значение этой пространственной модели в том, что она хорошо объясняет физико-химические и биологические свойства ДНК и, особенно механизм воспроизведения.

        Проведенные в последнее время исследования ставят на повестку дня вопрос, служит ли ДНК единственной структурой, несущей генетическую информацию, или хранение и передача информации осуществляется в клетках также и на других уровнях.

        Очевидно в настоящее время единственной системой потока информации суть которой мы начинаем постигать - это система исходным пунктом которой является ДНК. Открытие этой системы потока информации - триумф современной биологии.

        В настоящее время выясняется, что ДНК не есть абсолютное начало биохимического потока информации, т.к. на нее могут оказывать влияние сигналы, поступающие к ней из других участков клетки.

         Радиоавтография дает возможность наиболее полно изучить обмен веществ в различных структурах. В основе метода лежит использование радиоактивных элементов или меченных ими соединений. Радиоактивные вещества в гистологических срезах выявляются с помощью фотоэмульсии, которую наносят на препараты и затем проявляют. Этот метод позволяет определить скорость обменных процессов в клетках и тканях, их характеристики. Например, скорость включения меченных аминокислот в белки, образование нуклеиновых кислот, обмен иода в клетках щитовидной железы.

       Культура тканей вне организма. Выделенные из организма человека или животных клетки, маленькие образцы тканей различных органов, помещаются в специальные сосуды, которые содержат питательную среду - плазму крови, эмбриональный экстракт и стимуляторы роста клеток. Поддерживается постоянная температура близкая к температуре тела. В этих условиях клетки в течение длительного времени сохраняют основные показатели жизнедеятельности - способность к росту, размножению, дифференцировке, движению. Особую значимость метод культуры тканей имеет при проведении экспериментальных исследований на клетках и тканях человека.

      Витальное (прижизненное) и суправитальное окрашивание. .При витальном окрашивании краситель вводится в организм животных. Он избирательно окрашивает определенные клетки или ткани. Например трипановый синий избирательно окрашивает макрофаги. Суправитальным окрашивание  .называется окрашивание живых клеток, выделенных из организма.

        Электронный микроскоп. Современная физика рассматривает световые волны не только как электромагнитные волны определенной длины и частоты.Это поток частиц, именуемых квантами или фотонами. С другой стороны электроны не только частицы с определенной массой. Летящий электрон можно рассматривать как волну, длина которой выводится из уравнения де Бройля. Чем быстрее движится электрон, тем меньше длина его волны. Разогнать электрон в пустоте можно ускоряющим напряжением. Если оно составляет 50 киливатт, длина волны электрона около 0,05А - в сто раз меньше длины волны зеленого света! Электроны можно отклонять магнитными линзами, попросту электромагнитами.

       На основе изложенных положений был создан электронный микроскоп, который по внешнему виду существенно отличается от микроскопа Левенгука, но принцип работы обоих приборов одинаков.

       Рассмотрим некоторые моменты конструкции электронного микроскопа в сравнении с оптическим.

      Оптический микроскоп начинается с осветителя - источника энергии. Левенгук использовал для этой цели солнце или коптящую маслянную лампу. За триста лет осветитель проделал изрядный путь, превратившись в лучших конструкциях микроскопа в монохроматор, дающий свет строго определенной длины волны, что устраняет хроматическую абберацию.

       В электронном микроскопе в качестве осветителя выступает электронная пушка, в которой источником электронов служит раскаленная до 2000 градусов вольфрамовая нить. Оптические системы электронного микроскопа представлены электромагнитами или постоянными магнитами, которые выполняют роль конденсатора, объектива, окуляра. Получаемое изображение проектируется на экран аналогичный экрану телевизора.

Рис. 1.6. Световой микроскоп

Рис. 1.7.Электронный микроскоп

                                                     

                     

             А                                       Б                                        В

   Рис. 1.8.Оптические схемы ( А ) светового микроскопа , ( Б ) трансмиссионного и ( В ) сканирующего электронных микроскопов ( по M. Ross ).

 

         Сканирующий (растровый) электронный микроскоп позволяет изучить трехмерную картину поверхности клетки. При сканирующей электронной микроскопии тонкий пучок электронов (зонд) пробегает по поверхности объекта и полученная информация передается на электронно-лучевую трубку. Изображение может быть получено в отраженных или вторичных электронах. При этом методе фиксированный и специальным образом высушенный объект покрывается тонким слоем испаренного металла (чаще всего золота), отражаясь от которого электроны попадают в приемное устройство, передающее сигнал на электронно-лучевую трубку. Благодаря огромной глубине фокуса сканирующего микроскопа, которая значительно больше, чем у просвечивающего, получается почти трехмерное изображение исследуемой поверхности (См.рис. В). Разрешающая способность этого типа приборов несколько ниже, чем у просвечивающих электронных микроскопов, но уже сейчас выпускаются приборы с разрешением 3—5 нм.

        С помощью растровой электронной микроскопии можно получить информацию о химическом составе в тех или иных участках клеток. Так, метод рентгеноспектрального микроанализа основан на .идентификации и количественной оценке содержания химических элементов по спектрам характеристического рентгеновского излучения, возникающего при взаимодействии первичных электронов с атомами. Для получения такой информации, конечно, объекты не следует покрывать слоем металла, как при обычном методе сканирующей электронной микроскопии. Более того, объект нужно подготовить так, чтобы не было потери или дополнительного внесения элементов. Для этого используют быстро замороженные и высушенные в вакууме объекты.

          Рекордное разрешение современного электронного микроскопа меньше 1,5А.Теоретически разрешающая способность электронного микроскопа около 0,025А.Практически дальше 1,5А идти трудно - мешают абберации. Электронныей микроскопы первого класса увеличивают в 250 тысяч раз.Этот прорыв в тайны микромира не уступает по своему значению тому, который  300 лет назад совершил А.Левенгук. Сравните 1,5А и 700 тыс.А (0,07мм) таковы размеры пути, пройденного человечеством в этой области знаний от Левенгука до наших дней за 300 лет.