22. Оптический микроскоп. Ход лучей в микроскопе. Полезное увеличение микроскопа.

Микроскоп — оптический прибор для получения увеличенных изображений объектов (или деталей их структуры), невидимых невооружённым глазом.

Микроскоп применяют для получения больших увеличений при наблюдении мелких предметов. Увеличенное изображение предмета в микроскопе получается с помощью оптической системы, состоящей из двух короткофокусных линз — объектива O1 и окуляра O2. Объектив даст действительное перевернутое увеличенное изображение предмета. Это промежуточное изображение рассматривается глазом через окуляр, действие которого аналогично действию лупы. То есть изображение в микроскопе получается перевернутым. Окуляр располагают так, чтобы промежуточное изображение находилось в его фокальной плоскости; в этом случае лучи от каждой точки предмета распространяются после окуляра параллельным пучком.

Полезное увеличение микроскопа - такое увеличение, при котором предмет, имеющий размер, равный пределу разрешения микроскопа, имеет изображение, размер которого равен пределу разрешения глаза.

Полезное увеличение микроскопа находится в области 500 - 1000-кратной величины апертуры объектива. Нормальным увеличением микроскопа называется такое, которое получается при 500 А и диаметре зрачка выхода, равном 1 мм.

Полезное увеличение микроскопа в среднем равно 1000-кратному.

Полезное увеличение микроскопа определяется увеличением объектива, поэтому на совершенствование объективов обращается серьезное внимание.

Полезное увеличение N микроскопа должно быть подобрано так, чтобы при этом была рациональным образом использована разрешающая сила объектива микроскопа. Для этого необходимо, чтобы угловая величина изображения наблюдаемой детали по отношению к центру зрачка глаза была бы не меньше 2 минут, а еще лучше, как принято считать, доходила бы до 4 минут, что обусловлено разрешающей способностью глаза.

23. Разрешающая способность и предел разрешения микроскопа. Пути повышения разрешающей способности.

Одной из важнейших характеристик микроскопа является его разрешающая способность. Разрешение — способность оптического прибора воспроизводить изображение близко расположенных объектов. Линейный предел разрешения микроскопа, то есть минимальное расстояние между точками предмета, которые изображаются как раздельные, зависит от длины волны и числовой апертуры микроскопа:

σ=λ/2A

Апертура — характеристика оптического прибора, описывающая его способность собирать свет и противостоять дифракционному размытию деталей изображения.

A = nSin(α/2), где n — показатель преломления той среды, в которой находится предмет и из которой исходят лучи, а α — угол, составляемый крайними лучами, идущими из предмета и попадающими еще в объектив.

Повысить разрешающую способность микроскопа можно двумя способами: либо увеличивая апертуру объектива, либо уменьшая длину волны света, освещающего препарат.

24.Специальные методы микроскопии: метод темного поля, поляризационный, люминесцентный микроскоп.

Метод исследования в темном поле впервые был предложен австрийскими

учеными Р. Зигмонди и Р. Зидентопфом в 1903 году и подходит для

рассеивающих свет объектов.

В основе метода лежит освещение препарата полым конусом света,

внутренняя апертура которого превосходит числовую апертуру применяемого

объектива. Поскольку ни один прямой луч от

осветителя в объектив попасть не может, при

отсутствии объекта поле зрения микроскопа

будет темным. Объект, помещенный на

предметный столик, будет рассеивать свет во

все стороны, в том числе и в сторону объектива,

благодаря чему на темном фоне будет видно

контрастное изображение объекта.

В микроскопе проходящего света тип

освещения создается посредством кольцевой

диафрагмы в конденсоре (рис. 8). В случае,

когда в исследованиях используется объектив с

высокой числовой апертурой, есть вероятность,

что часть света все же будет попадать объектив.

По этой причине используются

специализированные объективы, имеющие

встроенную внутреннюю ирисовую диафрагму,

которая позволяет уменьшать эффективное значение NAobj до величины,

достаточной для наблюдения в темном поле.

Поляризационная микроскопия – это метод наблюдения в поляризованном свете для микроскопического исследования препаратов, включающих оптически анизотропные элементы (или целиком состоящих из таких элементов). Таковыми являются многие минералы, зёрна в шлифах сплавов, некоторые животные и растительные ткани и пр. Оптические свойства анизотропных микрообъектов различны в различных направлениях и проявляются по-разному в зависимости от ориентации этих объектов относительно направления наблюдения и плоскости поляризации света, падающего на них. Наблюдение можно проводить как в проходящем, так и в отражённом свете. Свет, излучаемый осветителем, пропускают через поляризатор. Сообщенная ему при этом поляризация меняется при последующем прохождении света через препарат (или отражении от него). Эти изменения изучаются с помощью анализатора и различных оптических компенсаторов. Анализируя такие изменения, можно судить об основных оптических характеристиках анизотропных микрообъектов: силе двойного лучепреломления, количестве оптических осей и их ориентации, вращении плоскости поляризации, дихроизме.

Метод исследования в свете люминесценции (люминесцентная микроскопия, или флуоресцентная микроскопия) состоит в наблюдении под микроскопом зелено-оранжевого свечения микрообъектов, которое возникает при их освещении сине-фиолетовым светом или не видимыми глазом ультрафиолетовыми лучами. В оптическую схему микроскопа вводятся два светофильтра. Один из них помещают перед конденсором. Он пропускает от источника-осветителя излучение только тех длин волн, которые возбуждают люминесценцию либо самого объекта (собственная люминесценция), либо специальных красителей, введённых в препарат и поглощённых его частицами (вторичная люминесценция). Второй светофильтр, который установлен после объектива, пропускает к глазу наблюдателя (или на фоточувствительный слой) только свет люминесценции. В люминесцентной микроскопии используют освещение препаратов как сверху (через объектив, который в этом случае служит и конденсором), так и снизу, через обычный конденсор. Наблюдение при освещении сверху иногда называют «люминесцентной микроскопией в отражённом свете» (этот термин условен — возбуждение свечения препарата не является простым отражением света). Его часто используют совместно с наблюдением по фазово-контрастному методу в проходящем свете. Метод нашел широкое применение в микробиологии, вирусологии, гистологии, цитологии, в пищевой промышленности, при исследовании почв, в микрохимическом анализе, в дефектоскопии. Такое многообразие применений объясняется очень высокой цветовой чувствительностью глаза и высокой контрастностью изображения самосветящегося объекта на тёмном нелюминесцирующем фоне. Кроме того, информация о составе и свойствах исследуемых веществ, которую можно получить, зная интенсивность и спектральный состав их люминесцентного излучения, имеет огромную ценность.