[Rukavishnikov_A.I.]_Azbuka_raka(BookFi.org)

вая клетка вызовет ответ Т- и В-лимфоцитов иммунной системы (Г.П. Георгиев и соавт., 2003).

Часто в практике в качестве цитокина используют: GM-CSF – стимулятор образования колоний гранулоцитов и макрофагов, а также IL-2, IL-12 и др.

Под влиянием цитокина раковая клетка атакуется антигенпрезентирую-

щимися клетками – дендритные клетки, макрофаги и В-лимфоциты. Такая кле-

тка захватывает белок-антиген и расщепляет его до пептидных фрагментов, ко-

торые связываются внутри клетки с молекулами HLA I класса и представляют-

ся Т-лимфоцитам. Они после «обучения» распознаванию антигенов раковой клетки становятся цитотоксическими Т-лимфоцитами, и, атакуя их, уничтожа-

ют раковые клетки.

Вначале путѐм биопсии опухоли берѐтся из неѐ фрагмент. Из его клеток выращивают на питательной среде колонию раковых клеток. Методом транс-

фекции вводят в эти клетки ген, кодирующий данный цитокин, с промотором,

регулирующим экспрессию данного гена. Затем эти модифицированные рако-

вые клетки облучают и вводят обратно, в организм пациента. В организме они синтезируют цитокин, и цитотоксические Т-лимфоциты находят по белкам-

антигенам раковые клетки, в том числе клетки метастазов, и уничтожают их.

Проф. С.Л. Киселѐв и его группа под руководством акад. Г.П. Георгиева

(1998) впервые открыли «ген tag7» у человека, который кодирует белок Tag-7,

клонировали его, изучили структуру и структуру его белка. Это новый ген и новый белок.

Об этом гене и его продукте – белке Tag7 стало известно следующее.

1. B подавляющем числе раковых клеток разного типа ген не экспресси-

руется, т.е. его иРНК нет среди иРНК в этих раковых клетках. Другими слова-

ми, с возникновением раковой клетки любого типа этот ген «не связан».

2.Ген экспрессируется в различного типа лимфоцитах, «причѐм его белок

–Tag7 образуется только в части этих клеток», и преимущественно ло-

кализуется на наружной мембране клеток.

290

3.Белок гена выявляется в разных клетках – макрофагах и других типах клеток «в зонах на границе с окружающей организм средой».

4.Белок гена отсутствует в большинстве раковых клеток, но он имеется в клетках стромы опухоли, а также в межклеточном пространстве, т.е. это секре-

тируемый во внешнюю среду белок.

Изучение свойств белка – продукта гена tag7 выявило следующее:

1) Инкубация разных типов раковой клетки с культуральной средой, со-

держащей белок Tag7, показала, что этот белок токсичен для раковых клеток:

значительная часть клеток-мишеней подвергается апоптозу, «такая гибель кле-

ток под влиянием Tag7» достигает максимума уже через 6 часов.

2) Высокая цитотоксичность белка Tag7 создаѐт трудности при работе с

ним.

При трансфекции нормальных клеток в культуре геном tag7 с промото-

ром в случае синтеза ими большого количества белка Tag7, такие клетки в ско-

ром времени от него погибали. Только клетки с низким уровнем синтеза белка,

способны нормально жить в культуре.

3) Подавление роста опухоли при экспрессии еѐ клетками, введѐнного в

них гена tag7.

Было отобрано две группы раковых клеток: контрольная без модифика-

ции геном tag7, а другая группа – с модификацией этим геном под контролем промотора.

Произведена перевивка раковых клеток подкожно в область бедра изо-

генным мышам. В контрольной группе возникли опухоли, они быстро росли и через 1-1,5 месяца мыши погибали.

Опухоли из модифицированных раковых клеток «росли в несколько раз медленнее и даже через 4 месяца размеры их не достигали размеров опухолей контрольной группы, которые они имели через месяц». Кроме этого, у «боль-

шинства мышей в этой группе через более длительные сроки опухоли рассоса-

лись».

291

Изменялся и характер роста опухоли. В контрольных опухолях уже через две недели возникали некрозы, а в опухолях, из клеток, синтезировавших Таg7,

некроза не было.

Используя антитела против Tag7, учѐные установили, что «подавление роста опухоли непосредственно связано с образованием белка Таg7».

4) Ингибирование роста немодифицированной опухоли у мышей транс-

фецированными геном tag7 раковыми клетками. Для этого в одно бедро мыши прививали трансфецированные геном tag7 раковые клетки, а в другое бедро – клетки немодифицированной опухоли, «которые служили моделью метастаза».

И в этом случае модифицированные раковые клетки подавляли рост от-

далѐнной немодифицированной опухоли. Степень подавления роста опухоли была от «почти полного подавления до умеренного эффекта».

При введении животному немодифицированных раковых клеток вблизи от привитых трансфецированных геном tag7 раковых клеток, рост опухоли из этих клеток подавлялся. При этом в раковых клетках резко снижалось количе-

ство делящихся клеток, и во многих раковых клетках возникал апоптоз. Через несколько месяцев опухоли рассасывались – за счѐт апоптоза, а опухоли без введения в еѐ клетки гена tag7 быстро росли, и животное погибало через месяц.

5) Роль гена tag7 в защите против раковых клеток.

Цитотоксические Т-лимфоциты распознают раковые клетки в организме животного по наличию на раковой клетке чужеродного белка Tag7 и атакуют их.

При контакте таких активированных цитотоксических Т-лимфоцитов с раковыми клетками, они выделяют токсические белки, которые вызывают апоптоз в раковых клетках.

Токсические белки присутствуют в среде в очень малом количестве, сре-

ди них был обнаружен белок Tag7. Антитела против белка Tag7 подавляли ток-

сичность на 90%. Отсюда ясно, что токсичность вызывается в основном белком

Tag7, выделяемым цитотоксическими Т-лимфоцитами.

292

6) Профилактическое действие нежизнеспособных раковых клеток, син-

тезирующих белок Tag7.

Для этого были использованы клетки меланомы мыши, в них ген tag7 не экспрессируется.

Одну группу мышей иммунизировали клетками меланомы, в которые не вводили ген tag7. Другую группу мышей иммунизировали клетками меланомы,

в которые ген tag7 с промотором был введѐн с помощью липосом. Такие клетки экспрессируют ген в течение нескольких дней, а затем обычно погибают. Через неделю мышам обеих групп подкожно прививали клетки мышиной меланомы.

Вакцинация немодифицированными клетками меланомы «никакого влия-

ния на рост у животного перевитой меланомы не оказывала». Зато рост приви-

той такими клетками меланомы у мышей, иммунизированных модифицирован-

ными клетками меланомы, сильно подавлялся: «у части мышей опухоли из этих клеток вообще не возникали, а у других рост меланомы был замедлѐн».

Для дополнительного контроля, учѐные модифицировали также клетки меланомы введением в них гена наиболее эффективного цитокина, стимули-

рующего образование колоний гранулоцитов и макрофагов, т.е. GM-CSF.

Оказалось, что профилактическое действие белка Tag7 было даже более сильным, чем у GM-CSF.

Результаты изучения гена tag7 и свойств его продукта – белка Tag7 по-

зволило учѐным создать на основе гена ДНК-вакцину для лечения рака. Это было тщательно проверено при лечении рака в опытах на мышах. Вот еѐ основ-

ные этапы.

1.Мышам подкожно вводятся раковые клетки. Из них возникает рак. Без лечения такие мыши погибают от рака через несколько недель.

2.В такие раковые клетки методом трансфекции в культуре вводится ген

tag7 вместе с промотором. Для этого в питательную среду добавляют ген tag7

или вводят в составе липосом, либо заражают клетки вирусом, содержащим этот ген с промотором; модифицированные клетки облучают для инактивации размножения – это ДНК-вакцина.

293

3. Мышам с раковой опухолью делается прививка вакцины подкожно инъекцией еѐ. Клетки вакцины продуцируют белок Tag7. Этот белок-антиген появляется на поверхности раковых клеток. Так как для организма мыши этот белок чужеродный, то иммунная система узнаѐт этот белок, и вырабатывает от-

вет и на него, и на раковые клетки – носители белка, уничтожая их. Иммунный ответ будет в виде антител через активацию В-лимфоцитов и выработку цито-

токсических Т-лимфоцитов.

Введение такой вакцины, раковые клетки которой синтезируют цитокин

Tag7, не просто активирует иммунную систему мыши, но вынуждает еѐ прице-

льно атаковать раковые клетки. Это приводит к подавлению роста рака у мы-

шей, во многих случаях опухоли рассасываются за счѐт апоптоза раковых кле-

ток от токсического действия на клетки белка Tag7. У мышей вырабатывается иммунитет против того типа раковой клетки, которая входит в состав вакцины.

Повторная прививка тех же раковых клеток, против которых применялась вак-

цина, ведѐт к отторжению их. Но «в случае прививки раковых клеток, другого типа, защита отсутствует».

Этот метод лечения рака и предупреждения рецидива рака в опытах на мышах дал очень хорошие результаты, что позволило применить его в клини-

ческой практике. При этом ученые считают важным разработку методов введе-

ния гена tag7 или его белка «непосредственно в опухоль, минуя этап работы с раковыми клетками вне организма». Для этого могут быть использованы раз-

ные средства их доставки – липосомы, вирусы и др. (Рис.1).

294

клинические эксперименты по генной терапии, которые уже несколько лет ве-

дут в Европе и США.

Вакцина, разработанная в Институте биологии гена РАН, основана на ге-

нетическом модифицировании опухолевых клеток. Учѐные нашли, а затем кло-

нировали ген белка Tag7, который может уничтожать раковые клетки. В здоро-

вом организме такие белки должны вырабатывать клетки иммунной системы – лимфоциты – в ответ на попадание в организм чужеродных клеток, в том числе и раковых. Однако раковые клетки организм иногда принимает как ―свои‖, и

иммунный ответ, призванный их уничтожить, не развивается.

Именно эту ошибку исправляет вакцина. Чтобы добиться реакции пора-

женного организма, берут кусочек опухолевой ткани, вводят в него ген белка-

убийцы, а затем эту ткань возвращают в организм человека. В результате им-

мунная система ―учится‖ распознавать и убивать раковые клетки сначала в оп-

ределенном месте, а затем во всем организме в целом.

Предварительные эксперименты на животных показали, что иммунитет к определенному виду рака под действием вакцины возникает в 70% случаев. У

животных, которым удаляли опухоль хирургически, она повторно появлялась в три-четыре раза реже.

Для ―размножения‖ генетически изменѐнных клеток в изъятой из орга-

низма опухолевой ткани требуется 2-3 месяца. Чтобы не упускать драгоценное для ракового больного время, можно пересаживать ткань с модифицированны-

ми клетками, ранее полученную от другого больного. Сейчас в онкологическом центре началось создание ―банка данных‖ модифицированных опухолевых кле-

ток меланомы, которое позволит каждому пациенту подобрать ткань, совмес-

тимую с его организмом».

В связи с этой целью, проф. С.Л. Киселев (2003) говорит: «Задача эта могла быть решена, если бы в опухолях разных больных содержались одинако-

вые белки, которые иммунная система воспринимала как чужеродные и уни-

чтожала вместе с опухолями. И учѐные нашли такие белки, исследовав огром-

ное количество больных, – те же самые маркеры, опухолевые антигены.

296

Оказалось, что «в отличие от самих раковых клеток, которые индивиду-

альны у каждого больного, маркеры одинаковы у 70% пациентов. А значит и иммунная система этих больных, активированная вакциной, будет реагировать на маркеры одинаково».

«Правда, речь не идѐт об универсальной панацее – от всех видов рака», –

говорит учѐный. – Да, очевидно, это и невозможно: в отличие от других боле-

зней этот недуг разнообразен, и каждый его вид имеет свои специфические особенности».

В настоящее время используются две схемы вакцинации от рака: 1) ауто-

логичная, т.е. пациенту вводят его же раковые клетки, генетически модифици-

рованные с помощью гена tag7, и 2) аллогеничная, т.е. используются не свои, а

модифицированные раковые клетки геном tag7 от других пациентов, которые уже получали эту вакцину.

10.5. РНК-вакцина – новый способ поиска и уничтожения раковых

клеток

Стандартная лучевая терапия и химиотерапия рака не различают раковые клетки от нормальных клеток, что приводит к гибели последних. То есть оба вида лечения с тяжѐлыми побочными эффектами и не уничтожают все раковые клетки в организме пациента.

Раковая клетка отличается от нормальной клетки наличием на своей по-

верхности белков-антигенов. При сравнении белков, синтезируемых раковой и нормальной клетками одного и того же типа, можно выявить разницу в составе белков. Белки, характерные для раковой клетки и отсутствующие в нормальной клетке, и есть те самые белки-антигены, которые должна распознавать иммун-

ная система пациента.

Но раковая клетка – это «продукт» из нормальной клетки собственного организма. Путем размножения за счѐт бессмертия и распространения еѐ по-

томков за счет свойства к инвазии, она создает самую опасную для человека

297

болезнь – рак.

Протеом раковой клетки кодируется геномом организма-хозяина, что обусловливает его толерантность и отсутствие иммунного ответа. Известны и другие причины этого.

Только иммунная система обладает системным воздействием против бел-

ков-антигенов на раковых клетках. Поэтому учѐные давно пытаются использо-

вать клетки иммунной системы пациента для уничтожения раковых клеток.

Так, в Германии для этого используется прививка из убитых раковых кле-

ток, взятых от самого пациента. Как пишут об этом авторы, благодаря прививке этих клеток, в иммунную систему поступает информация: «Так выглядит рако-

вая клетка, нападайте на неѐ!». Такое же происходит при прививках против ви-

русной инфекции, когда иммунная система пациента «ознакомлена» с антиге-

нами этого вируса и может усилить иммунный ответ.

Используются два способа прививки раковыми клетками, взятыми от са-

мого пациента.

В первом способе для изготовления прививочного материала берется 5

грамм «массы опухоли», причѐм первичной и взятой в первой операции или методом биопсии. Первая прививка пациенту вводится «с высокой дозой» уби-

тых облучением раковых клеток. После этого следуют поддерживающие при-

вивки 1-2 раза в месяц в зависимости от ответа иммунной системы пациента.

Такая терапия может продолжаться годы и, блокируя возникновение метаста-

зов, «не давать развиваться болезни».

Во втором способе для изготовления материала прививки используются дендритные клетки из предшественников крови и раковые клетки от пациента также из первичной опухоли. Дендритные клетки выращиваются отдельно в культуре с цитокинами. Раковые клетки выращиваются отдельно также в куль-

туре и затем из них выделяют белки-антигены. После этого для изготовления прививочного материала дендритные клетки обогащаются белками-антигенами от раковых клеток. Такую вакцину вводят в организм пациента.

За счѐт выращивания дендритных клеток в культуре с цитокинами им-

298

мунная система «надѐжно уничтожает раковые клетки» с помощью двух меха-

низмов: цитотоксическими Т-лимфоцитами и антителами к белкам-антигенам раковой клетки.

Авторы отмечают, что данная методика «активно используется в универ-

ситетских клиниках для уничтожения всех типов раковой клетки и даѐт убеди-

тельные позитивные результаты».

Однако, использование комбинации дендритных клеток и специфических белков-антигенов от раковой клетки и еѐ потомков требует идентификации та-

ких антигенов для каждого типа раковой клетки, что является нелѐгкой задачей.

Кроме того, далеко не для всех опухолей возможно получить достаточное ко-

личество белка, необходимого для запуска иммунного ответа.

Компания Merix Bioscience в 2001 г. начала разрабатывать новый подход к уничтожению раковых клеток, который будет подходящим для конкретного пациента. Еѐ метод заключается в стимулировании иммунной системы пациен-

та, что позволяет ей находить и уничтожать раковые клетки. Это достигается РНК-вакциной.

РНК-вакцина состоит из: 1) дендритных клеток от пациента, они контро-

лируют его иммунную систему, и 2) матричной РНК (мРНК или иРНК) из его же раковых клеток. Дендритные клетки готовятся из образцов крови от пациен-

та, а мРНК выделяется из раковых клеток материала биопсии этого пациента.

Как видно, эта вакцина не для профилактики рака, а для уничтожения ра-

ковых клеток уже возникшего у пациента рака. Этим онкологи и заняты до на-

стоящего времени. Однако, прогресс в молекулярной биологии и возникнове-

ние молекулярной медицины позволяют уже теперь перейти к диагностике и лечению от рака в досимптомном его периоде на уровнях: первой раковой клетки и еѐ первых потомков и даже предраковой клетки или клеток.

Чтобы понять смысл РНК-вакцины, необходимо вспомнить некоторые данные о гене и мРНК.

Ген – это фрагмент ДНК, кодирующий белок или белки. Специфический порядок или последовательность нуклеотидов, из которых состоит этот фраг-

299