Микробная флора человека – совокупность микроорганизмов, имеющихся у здоровых людей на коже, слизистых оболочках и в кишечнике. К важным факторам, приводящим к нарушению процессов пищеварения, относят изменение состава естественной микробной флоры человека, то есть так называемый дисбактериоз. Для лечения и профилактики дисбактериоза используют средства, нормализующие микробную флору человека, в первую очередь содержащие бифидобактерии. Такие живые микроорганизмы называются пробиотиками.

Классификация пробиотиков:

1. по количеству микроорганизмов, входящих в препарат: монокомпонентные (монопробиотики), монокомпонентные сорбированные, поликомпонентные (полипробиотики), комбинированные (синбиотики)

2. по составу: на бифидосодержащие, лактосодержащие, колисодержащие и состоящие из споровых бактерий и сахаромицет.

Требования, которым должны соответствовать данные препараты:

• Выживаемость бактерий, зависящая от технологии производства и условий хранения препарата

• Пробиотики должны быть фено- и генотипически классифицируемыми;

• Не должны быть патогенными;

• Должны быть кислотоустойчивыми;

• Способны к адгезии к кишечному эпителию;

• Способны к колонизации кишечника;

• Должны быть безопасными.

Для сохранения жизнеспособности бактерий при воздействии желудочного сока и желчи пробиотики заключают в кислотоустойчивые капсулы или иммобилизируют на пористых микроносителях.

1. Технологическая схема производства бакпрепаратов, нормализующих микрофлору кишечника.

Процесс получения бакпрепаратов вклю­чает следующие этапы: приготовление посевного материала и питательных сред; культивирование бактерий в ферментере; отделение, сгущение и сушку биомассы; фасовку, упаковку и би­ологический контроль продукта.

Посевной материал

Питательная среда

Стерилизация среды

Культивирование в ферментере

Отделение биомассы

Сгущение

Криопротекторы

Сушка

Маркировка, упаковка

Проверка качества

2.Производство Бифидумбактерина.

2.1.Характеристика препарата Бифидумбактерин.

Бифидумбактерин представляет собой лиофилизированную микробную массу живых бифидобактерий вида бифидум. Bifidobacterium bifidum — вид грамположительных анаэробных бактерий, относящихся к роду бифидобактерии (лат. Bifidobacterium).

Антитоксическое действие бифидобактерий бифидум обеспечивается быстрым заселением кишечника, восстановлением нормальной микрофлоры, которая препятствует проникновению токсинов во внутреннюю среду организма и, являясь естественным биосорбентом, аккумулирует в значительном количестве попадающие извне или образующиеся в организме токсические вещества. Бифидобактерии в высокой концентрации активизируют пристеночное пищеварение кишечника, синтез витаминов и аминокислот, усиливают защитную функцию кишечника и иммунную защиту организма.

По внешнему виду препарат представляет собой кристаллическую или пористую массу бежевого или беловато-серого цвета. В состав препарата входят сахароза и желатин, которые являются компонентами стабилизирующей среды высушивания. Препарат выпускают в виде сухой биомассы, лиофилизированной в ампулах или флаконах. Массовая доля влаги сухого препарата должна быть не более 3,5%.

2.2.Технология производства препарата.

Технология производства бифидумбактерина включает следующие стадии: приготовление питательных сред, выращивание посевного материала, культивирование бифидобактерий на элективной питательной среде, подготовку и внесение защитной среды, сублимационное высушивание, приготовление лекарственных форм; контроль готового препарата.

1.Приготовление питательных сред. Для культивирования бифидобактерий используют среду Блоурокка или среду на основе гидролизата казеина (гидролизатно-молочную или гидролизатно-дрожжевую). В состав среды Блоурокка входят агар микробиологический, натрий хлористый, пептон сухой, лактоза, печеночный бульон, цистин. Срок хранения питательной среды не более 7 сут при температуре (20±5)°С. Срок хранения сред на основе гидролизата казеина не более 72 ч при температуре (20 ± 5)°С.

2.Стадия выращивания посевного материала. Биологическим агентом для получения бифидумбактерина является штамм Bifidobacterium bifidum №1. Посевы бифидобак­терий инкубируют при температуре (38 ± 1)°С в течение (60 ± 12) ч. Контрольные посевы инкубируют при температуре (22 ± 2) °С в тече­ние 8 сут. При этом получают бифидобактерий 1-ой генерации.

Следующий этап - получение бифидобактерий 2-ой генерации. Засев культуры проводят из расчета 10 % от объема среды. Культура бифидобактерий и контрольные посевы инкубируют при той же температуре в матрасах, что и для посева 1-ой генерации. Общее время также аналогично времени для посевов 1-ой генерации. Контроль посевной культуры проводится при высевании бифидобактерий 2-ой генерации в пробирки с глюкозой, средой Сабура и приготовле­нии мазка, окрашенного по Грамму.

При отсутствии роста в контрольных пробирках и наличии типичного роста бифидобактерий в виде рыхлого зернистого осадка, полученную культуру используют для посева в биореактор.

3.Культивирование. Культивирование бифидобактерий проводят в биореакторах. После проверки на герметичность и обработки фильтров биореактор стерилизуют при 30°С в течение 90 мин. Затем в него вводят гидролизатно-молочную или казеиново-дрожжевую среду. Питательную среду повторно стерилизуют в биореакторе путем подачи пара в рубашку аппарата. После охлаждения простерилизованной среды до температуры культивирования (38±1)°С в асептических условиях отбирают стерильную пробу для контроля стерильности питательной среды.

Засев питательной среды проводят бифидобактериями 2 - 3-ей генерации при температуре (38±1)°С. Процесс культивирования бифидобактерий в биореакторе длится 6-8 часов. Пробы культуральной жидкости из аппарата отбирают через каждые 2 часа для определения оптической плотности, специфической активности, проверки значений рН и для контроля чистоты культуральной жидкости. После засева питательной среды в процессе выращивания необходимо:

• Следить за температурой культивирования (38±1)°С;

• Давление в аппарате поддерживать в пределах 0,03 -0,04 МПа;

• Мешалку в аппарате включать на несколько минут (2-3 минуты) только перед отбором проб и после подачи 5% раствора аммиака, частота перемешивания 70-100 о6/хв;

• РН в аппарате поддерживать в пределах 6,3-6,5, корректируя 5% раствором аммиака.

Замер рН и температуры в аппарате производится автоматически. По окончании процесса культивирования показатель рН устанавливают в пределах 6,3-6,5, после чего микробную суспензию охлаждают подачей холодной водопроводной воды в рубашку аппарата.

После культивирования проводят контроль биомассы. Биологи­ческая концентрация бифидобактерий должна быть не менее 10⁸ клеток/мл, посторонняя микрофлора должна отсутствовать, рН = 7,1 ± 0,1. Затем готовят среду высушивания и вводят в биореактор. Био­массу со средой высушивания перемешивают (3 ± 0,5) мин механи­ческой мешалкой, разливают в стерильные емкости аппарата «Маг­нолия» и передают на участок розлива в ампулы.

4.Сублимационное высушивание биомассы. Розлив биомассы в ам­пулы производится при постоянном перемешивании. В начале, сере­дине и конце розлива отбирают пробы для определения посторон­ней микрофлоры и жизнеспособности бифидобактерий, равномер­ности и точности розлива. Заполненную ампулами кассету прикрывают несколькими слоями стерильной марли, металлической крыш­кой и передают для замораживания.

Лиофилизация промежуточного продукта осуществляют в лиофильной сушильной установке марки ТГ - 50, а предварительную заморозку проводят в установке глубокой заморозки. В комплект ТГ - 50 входят:

• Вакуумная установка, в том числе: сушильная камера, конденсатор, пластинчато-роторный вакуум-насос, термостат;

• Холодильная установка;

• Распределительный шкаф.

Охлаждение или нагрев полок осуществляется за счет подачи в полость полок, соответственно, хладоносителя фреона или водно-глицериновой смеси (глизантина). В процессе лиофильной сушки удаленная из продукта влага конденсируется на поверхности конденсатора, охлаждается фреоном.

Поступившие кассеты с производственной культурой загружают в установки глубокой заморозки, предварительно сняв с них крышки. Установку охлаждают до температуры минус 45ºС путем подачи фреона в змеевиковый испаритель. После достижения заданной температуры кассеты с препаратом держат в установке 3 часа. Общее время замораживания препарата 24 часа.

По окончании замораживания кассеты с замороженным препаратом немедленно перегружают в сушильную камеру установки ТГ-50 по 36 кассет в одну установку. Полки установлены предварительно охлаждают до температуры минус 34-36ºС. Дверь камеры герметично закрывают, включают вакуум-насос и подают фреон в конденсатор. При достижении температуры в конденсаторе минус 45°С, соединяющих конденсатор с сушильной камерой (открывают задвижку) и начинают процесс основной сушки. Сушку осуществляют при следующих параметрах:

• Величина вакуума: 50-70 Па;

• Температура полок: минус 34-36°С;

• Температура продукта на полках: минус 34-36°С.

Охлаждение фреона осуществляется оборотной водой. Через три часа от момента загрузки кассет с препаратом в сушильную камеру прекращают подачу фреона в полки и начинают подачу в полки глизантина, температура которого соответствует температуре окружающей среды. В течение 20-25 часов глизантин циркулирует через полки сушильной камеры, после чего включают ТЭНы, чтобы увеличить температуру глизантина. Ее постепенно повышают на 1-4ºС в час до достижения 28-30ºС.

После достижения температуры продукта на полках сушильной камеры 28-30ºС процесс сушки продолжают в течение 6 часов. Общее время проведения процесса сушки (от начала замораживания продукта в установке глубинного заморозки) составляет 96 часов.

По окончании сушки закрывают задвижку (отсоединяют сушильную камеру от конденсатора), отключают вакуум-насос, отключают подачу фреона в конденсатор, отключают насос циркуляции глизантина. Далее подают в камеру стерильный воздух. После окончания процесса высушивания производится запайка ампул. Герметизацию ампул осуществляют не позднее 72 ч после окончания лиофилизации на автомате для запайки ампул в атмосфе­ре азота.

5.Получение готовой лекарственной формы. Пятой стадией производства бифидумбактерина является маркировка и упаковка препа­рата. В помещении контроля производят проверку герметичности ампул и визуальный контроль. Ампулы, прошедшие контроль и осмотр, отправляют на маркиро­вочную машину, затем укладывают по 10 штук в пачки из картона. В каждую пачку вкладывается инструкция по применению препарата.

6.Контроль готового препарата осуществляется по следующим показателям: физические свойства, внешний вид, отсутствие посторон­ней микрофлоры, количество живых бифидобактерий в одной дозе препарата, активность кислотообразования, остаточная влажность, рН, герметичность.