Тема № 1. Аминокислоты. Обнаружение аминокислот

в биологических жидкостях.

Аминокислоты – органические соединения, содержащие в молекуле две функциональные группы – карбоксильную (-COOH) и аминогруппу (-NH₂).

Биологическое значение аминокислот:

1) являются структурными компонентами белков всех живых организмов, в том числе и человека;

2) служат предшественниками многих низкомолекулярных биологически активных веществ: ГАМК (γ – аминомасляная кислоты), биогенных аминов, гормонов (гормоны щитовидной железы, надпочечников), азотистых оснований, входящих в состав нуклеиновых кислот, порфиринов, идущих на биосинтез гема (для гемоглобина и миоглобина), азотистых оснований, входящих в состав сложных липидов (холила, этаноламина), нейромедиаторов (ацетилхолин, дофамин, серотонин, норадреналин и другие.).

Основную роль в процессах жизнедеятельности играют белки, представляющие собой полимеры построенные из остатков 22 природных аминокислот. У растений все необходимые аминокислоты синтезируются из простейших соединений – углекислого газа, воды и аммиака. Однако человек и многие животные утратили способность синтезировать ряд белковых аминокислот, которые стали для них незаменимыми в питании: они обязательно должны поступать с пищей, т.е. в готовом виде. К ним относятся: лейцин, изолейцин, валин, метионин, треонин, триптофан, лизин, фениналанин.

Качественные реакции на аминокислоты

Цель: изучить состав и свойства аминокислот, познакомиться с качественными реакциями на аминокислоты.

Приборы и реактивы: штатив с пробирками, пипетка на 1 мл, концентрированная азотная кислота, раствор белка (белок двух яиц смешивают с литром дистиллированной воды), 20%-ный раствор гидроксида натрия, 10%-ный раствор сахарозы, концентрированная серная кислота, неразбавленный белок яйца,0,5% - ный раствор ацетата свинца.

Опыт 1. Ксантопротеиновая реакция

Реагентом в этой реакции служит концентрированная азотная кислота, которая дает возможность обнаружить в молекуле белка ароматические аминокислоты - фенилаланин, тирозин и триптофан. Эти аминокислоты содержат ароматические циклы (например, бензольное кольцо), которые легко реагируют с концентрированной азотной кислотой (реакция нитрования) с образованием нитросоединений, окрашенных в желтый цвет (греч. «ксантос» - желтый), отсюда и название – ксантопротеиновая реакция.

Порядок проведения эксперимента:

В пробирку наливают около 1 - 2 мл раствора белка и прибавляют 6-10 капель концентрированной азотной кислоты. Сразу появляется осадок белка, который при нагревании окрашивается в желтый цвет. Затем пробирку охлаждают и осторожно прибавляют избыток гидроксида натрия. При этом желтая окраска переходит в оранжевую.

Опыт 2. Реакция на триптофан

Реагентом на эту аминокислоту является сахароза (тростниковый сахар) в кислой среде (в присутствии концентрированной серной кислоты). Под действием серной кислоты происходит гидролиз сахарозы до глюкозы и фруктозы, которые обезвоживаются, превращаясь в оксиметилфурфурол. Триптофан при взаимодействии с оксиметилфурфуролом, образует комплекс вишнево - красного цвета.

Порядок проведения эксперимента:

В пробирку наливают около 1 мл раствора белка и добавляют 2 капли раствора сахарозы. Затем с помощью пипетки добавляют 1 мл концентрированной серной кислоты, которая в виде маслянистой жидкости опускается на дно пробирки, образуя два слоя. На границе раздела жидкостей появляется вишнево-красное окрашивание в виде кольца.

Опыт 3. Реакция на серосодержащие аминокислоты.

В состав молекул большинства белков входят серосодержащие аминокислоты – цистеин, цистин и метионин. При нагревании со щелочью от этих аминокислот отщепляется сера в виде сероводорода, который обнаруживают с помощью раствора нитрата или ацетата свинца:

CH₂SH CH₂OH

׀ ׀

1) CHNH₂ + 2 NaOH → CHNH₂ +Na₂S + H₂O

׀ ׀

COOH COOH

цистеин

2) Na₂S + ( CH₃COO ) ₂ Pb → 2 CH₃COONa + PbS

Порядок проведения эксперимента:

В пробирку наливают 1-2 мл белка и добавляют 1 – 2 мл раствора гидроксида натрия, нагревают до кипения, затем в пробирку добавляют 1-2 капли ацетата свинца. Наблюдают постепенное потемнение раствора: сульфид свинца – осадок черного цвета.

Контрольные вопросы и задания

1. Что такое аминокислоты?

2. Какие аминокислоты называют незаменимыми? Почему?

3. Каковы биологические функции аминокислот?

4. Назовите основные качественные реакции на аминокислоты.

5. Напишите формулу трипептида, образованного аланином, валином и цистеином.

Тема № 2. Белки. Переваривание белков в ЖКТ

Белки - высокомолекулярные биологические полимеры, построенные из остатков 20 аминокислот и двух амидов (аспарагин, глутамин) и обладающие своеобразными физико-химическими и важными биологическими свойствами.

Основные функции белков:

1. Структурная (пластическая): белки служат основным строительным материалом всех клеток и тканей, в особенности, мышечной ткани животных и человека.

2. Защитная: многие белки (так называемые антитела) оказывают нейтрализующее действие на ядовитые вещества или на микробы, попадающие в организм с пищей или через дыхательные пути.

3. Транспортная: некоторые белковые вещества участвуют в переносе (транспорте) других веществ, например, гемоглобин – красный белковый пигмент эритроцитов осуществляет транспорт кислорода из легких в ткани и клетки, углекислого газа из тканей в легкие, а оттуда – наружу.

4. Каталитическая: катализатор – вещество, ускоряющее химическую реакцию. Белки – катализаторы называются ферментами, или энзимами. При их участии протекают все биохимические реакции в клетке и организме в целом.

5. Регуляторная: вещества белковой природы регулируют многие жизненно – важные процессы в организме. Например, белок – инсулин регулирует обмен глюкозы в организме и ее содержание в крови.

6. Энергетическая: при расщеплении белков выделяется энергия (в виде тепла или АТФ), необходимая для процессов жизнедеятельности.

Белки подразделяют на две группы: простые, или протеины, и сложные, или протеиды.

Качественные реакции на белки обусловлены наличием в них определенных химических групп, связей и некоторыми их физико-химическими свойствами.

Качественные реакции на белки

Качественное обнаружение белков основано на двух типах реакций: а) по пептидным связям белковой молекулы; б) по аминокислотным радикалам в ее структуре. Все они еще называются цветными реакциями на белки.

Цель:изучить состав, свойства белков, их биологическую роль и качественные реакции на них. Рассмотреть особенности превращений белков в ЖКТ и уяснить роль соляной кислоты в процессах пищеварения. Опытным путем определить зависимость активности пепсина от температуры и кислотности среды, научиться определять pH желудочного сока.

Приборы и реактивы: Штатив с пробирками, водяная баня, шпатель, универсальная индикаторная бумага, 10% - ный растворы гидроксида натрия, 2% - ный раствор сульфата меди, раствор белка (белок двух яиц смешивают с литром дистиллированной воды), 0,2%-ный раствор нингидрина в спирте или ацетоне, 0,1%-ный раствор глицина, насыщенный раствор пикриновой кислоты, 0,1%-ный раствор глюкозы, сухой гидрокарбонат натрия, желудочный сок (раствор пепсина 1% в 0,2 М HCl), 10% - ный раствор соды (бикарбоната натрия).

Опыт 1. Обнаружение пептидных связей в молекулах белков (биуретовая реакция).

Пептидные связи в белках обнаруживаются с помощью гидроксида меди (II) Cu(OH)2; голубой осадок растворяется с образованием раствора комплексной соли, окрашенной в красно - фиолетовый цвет. Эта реакция обуславливается наличием пептидной связи: -HN-CO-

Название «биуретовая реакция» происходит от производного мочевины - биурета, который дает эту реакцию в соответствующих условиях. Биурет образуется при нагревании мочевины с отщеплением от нее аммиака:

H₂N —CO— NH₂ + H₂N —CO— NH₂ + нагревание →

мочевина

NH₃ + H₂N —CO— NH —CO— NH₂

биурет

Порядок проведения эксперимента:

Реакция с белком. К 1-2 мл раствора белка прибавляют двойной объем 10%-ного раствора гидроксида натрия, хорошо перемешивают и добавляют 2-3 капли 2%-ного раствора сульфата меди. Снова тщательно перемешивают. Развивается красно – фиолетовое окрашивание. При малом содержании белка чувствительность реакции можно повысить, наслаивая на раствор белка в щелочи 1%-ный раствор сульфата меди. При стоянии на границе двух слоев появляется фиолетовое кольцо.

Опыт 2. Нингидриновая реакция.

Реакция основана на взаимодействии аминогруппы свободных аминокислот и аминных групп белковой молекулы с нингидрином. Продукт этой реакции содержит в своем составе радикал (R) исходной аминокислоты, который обуславливает различную окраску (голубую, фиолетовую, красную и т.д.) соединений, возникающих при реакции аминокислот с нингидрином. В настоящее время нингидриновая реакция широко используется как для открытия отдельных аминокислот, так и для определения их количества в биологических объектах.

Порядок проведения эксперимента:

Сначала реакцию проводят с глицином (или какой – либо другой аминокислотой). Наливают в пробирку 2-3 мл раствора глицина, добавляют 2-3 капли раствора нингидрина и нагревают. Появляется фиолетовое окрашивание.

В другую пробирку наливают 2-3 мл раствора белка, приливают 2-3 капли раствора нингидрина. Раствор перемешивают и нагревают несколько минут на водяной бане. Наблюдают сине-фиолетовое окрашивание.

Опыт 3. Реакция с пикриновой кислотой.

Пикриновая кислота при нагревании с белком в щелочной среде восстанавливается в пикраминовую кислоту (красного цвета). Эту реакцию можно проделать и с другими восстановителями, например с глюкозой.

Порядок проведения эксперимента:

В пробирку наливают 2 мл раствора белка и прибавляют 0,3-0,5 г сухого гидрокарбоната натрия и 1 мл насыщенного раствора пикриновой кислоты, смесь нагревают в пламени горелки несколько минут. Желтая окраска раствора постепенно переходит в красную вследствие восстановления пикриновой кислоты к пикраминовую.

Опыт 4. Переваривание белка пепсином.

Желудочный сок – это прозрачная бесцветная жидкость с резко – кислой реакцией среды. За сутки у человека выделяется до 1,5 л желудочного сока. Пепсин разрывает пептидные связи в молекулах белков, особенно в местах наличия циклических аминокислот, и белки распадаются на пептоны. Реакция протекает при определенных условиях: pH = 1-2, t = 38 – 40 °C. В сутки образуется около 2 г пепсина, который способен расщепить за 2 часа 100 кг яичного белка.

Порядок проведения эксперимента:

В три пробирки налейте по 1 мл желудочного сока (или 1% - ный раствор пепсина в 0,5 % - ном растворе HСl). Содержимое первой пробирки прокипятите 2 мин на водяной бане для инактивации ферментов и охладите. Во вторую пробирку добавьте 5 капель раствора соды (бикарбонат натрия) для нейтрализации HCl желудочного сока. Во все три пробирки внесите по маленькому кусочку белка и поставьте на водяную баню (t=40°C) на 20 мин. Охладите содержимое пробирок и проделайте биуретовую реакцию: добавьте в каждую пробирку по 1 мл 10% - ного раствора гидроксида натрия и по 1-2 капли сернокислой меди. Наблюдайте окрашивание растворов. Если фермент активен, то кусочек фибрина подвергнется гидролизу до пептидов; если пепсин не активен, то фибрин набухает, но не переваривается. Заполните таблицу и сделайте вывод об активности фермента.

Таблица 1.

№ пробирки	Интенсивность окрашивания раствора
1
2
3

Опыт 5. Определение pH желудочного сока.

Соляная кислота желудочного сока играет важную роль в ферментативном гидролизе белков:

1) способствует набуханию пищевых белков, что облегчает их дальнейшее переваривание;

2) активирует пепсин и создает кислую среду для оптимального действия фермента;

3) обезвреживает бактерии, попадающие с пищей.

Для образования соляной кислоты клетки слизистой оболочки желудок должны получать энергию извне. При переваривании пищи, особенно мясной, на образование соляной кислоты из крови уходит очень много хлоридов.

Реакция образования HСl протекает по следующей схеме:

NaCl + NaHCO₃ + АТФ → HCl + Na₂CO₃ + АДФ + H₃PO₄

На каждую молекулу образовавшейся соляной кислоты затрачивается около 10 ккал. В желудочном соке соляная кислота составляет 0,4%, а pH желудочного сока – 1,5 – 2.

Порядок проведения эксперимента:

На универсальную индикаторную полоску поместите одну каплю желудочного сока и сравните со шкалой pH окрашивания полоски.

Контрольные вопросы и задания

1. Перечислите основные функции белков в организме.

2. С помощью каких реакций можно обнаружить пептидные связи и аминные группы в белковой молекуле?

3. Почему белки называют основой жизни?

4. Какие продукты питания наиболее богаты белками?

5. Что такое белковое голодание? К чему это может привести?

Тема № 3. Ферменты как биологические катализаторы. Механизм действия, регуляция активности ферментов

Ферментами называют специфические белки, выполняющие каталитические функции. С участием ферментов осуществляются многочисленные биохимические процессы, совокупность которых составляет сущность обмена веществ. Влияя на скорость метаболических реакций, ферменты способны эффективно регулировать процессы жизнедеятельности. Подобно неорганическим катализаторам, ферменты повышают скорость химических реакций за счет понижения энергии активации. Однако биологические катализаторы обладают более высокой эффективностью в снижении энергии активации и, как правило, осуществляют свою функцию в условиях умеренной температуры, нормального давления и значений pH, близких к 7(нейтральная среда). Вместе с тем ферменты чувствительны к изменению условий среды, в которой они функционируют, и имеют ряд особенностей, связанных с их белковой природой.

Общие свойства ферментов

Характерные особенности ферментов, их специфичность, чувствительность к изменению температуры и pHсреды, а также к наличию активаторов и ингибиторов обусловлены белковой природой биологических катализаторов.

Каталитическая активность фермента связана с наличием в его молекуле особых участков, ответственных за связывание и активирование субстрата, - субстратный и активный центры. Это уникальное сочетание аминокислотных остатков, расположенных в полипептидной цепи на большом расстоянии друг от друга. Сближаясь, они образуют каталитический центр при формировании третичной структуры молекулы. В ферментах – протеидах в образовании каталитических центров участвуют также не белковые компоненты, непосредственно прилегающие к активному участку глобулы. Любое внешнее воздействие, нарушающее нативную конформацию белковой молекулы, приводит к инактивации фермента.

Цель: Рассмотреть современные представления о структуре ферментов. Получить представления о роли ферментов. Ознакомиться с вопросами кинетики ферментативных реакций и регуляции активности ферментов.

Приборы и реактивы:Штатив с пробирками, пипетки, стакан (50 мл), спиртовка, термостат (37º С), стакан со льдом, разбавленная слюна (ополаскивают рот дистиллированной водой, а затем, набрав в рот 20 – 25 мл воды, собирают ее в стаканчик), 0,3 % и 1% - ный растворы хлорида натрия, 1 % - ный раствор крахмала на 0,3 % - ном растворе хлорида натрия, реактив Люголя, 1 % - ный и 0,5 % - ный растворы крахмала, 2 % - ный раствор сахарозы, реактив Фелинга, раствор сахаразы (10 г дрожжей гомогенизируют в 100 мл воды), 1% - ный раствор сульфата меди.

Опыт 1. Термолабильность ферментов

Температура среды сильно влияет на активность ферментов. Оптимальная температура для действия ферментов – температура тела животных, колеблющаяся в диапазоне 36 – 41 º С. При некотором повышении температуры среды происходит ускорение реакции вследствие повышения энергии активации молекул субстрата. Вместе с тем даже небольшое повышение температуры вызывает ослабление связей, которые поддерживают конформацию молекулы фермента, необходимую для проявления его каталитической активности. Постепенно начинается денатурация фермента, которая резко прогрессирует при температуре, превышающей 50ºС. Инактивация фермента при повышении температуры необратима. При понижении температуры фермент также уменьшает свою активность. Механизм этого явления не ясен. Однако денатурации фермента при охлаждении не происходит, поскольку инактивация фермента в этом случае может быть обратимой.

Принцип метода. Исследуется влияние изменения температуры внешней среды на активность фермента амилазы слюны.

Порядок проведения эксперимента.

В три пробирки наливают по 2 – 3 мл разбавленной слюны (амилаза). Слюну в пробирке № 1 кипятят в течение 1 – 2 мин и охлаждают. Затем во все пробирки добавляют по 4 – 5 мл крахмала. Пробирки № 1 и № 2 ставят в термостат (37º С) на 10 мин. Пробирку № 3 погружают на 10 мин в лед. По истечении указанного времени во все пробирки добавляют по 1 капле реактива Люголя. Результаты опыта заносят в таблицу термолабильности ферментов и делают выводы о влиянии температуры на их активность.

Таблица 2.

№ пробирки	Фермент	Условия опыта	Субстрат	Инкубация	Окраска с йодом
1	амилаза	Фермент денатурирован	крахмал	10 мин, 37ºС
2	амилаза	Фермент нативный	крахмал	10 мин, 37ºС
3	амилаза	Фермент нативный	крахмал	10 мин, 0ºС

Опыт 2. Влияние pH на активность ферментов

Для каждого фермента существует оптимум pH, при котором создаются наиболее благоприятные условия для поддержания функционально активной конформации молекулы. Наивысшую активность многие ферменты проявляют в изоэлектрической точке. Ионизированные при определенном значенииpHаминогруппы и карбоксильные группы аминокислотных остатков участвуют в поддержании конформации белковой молекулы, необходимой для образования каталитических центров фермента, и способствуют его связыванию с субстратом. При ином значенииpHионизация соответствующих групп изменяется, в результате разрываются связи, обеспечивающие образование каталитических центров, и фермент инактивируется. При очень высоких и низких значенияхpHферменты денатурируют. Оптимальные значения рН для пепсина составляет 1,5 – 2, амилазы слюны – 6,8 – 7, трипсина – 7,8, липазы поджелудочной железы – 7,0 – 7,8. Было, однако, показано, что ферменты, катализирующие одни и те же реакции, но выделенные из различных субстратов, проявляют оптимум действия при неодинаковых значениях рН. Оптимум рН амилазы слюны составляет 6,8 –7, а амилаза солода проявляет максимум каталитической активности при рН 4,4 – 4,5.

Принцип метода.Исследуется активность фермента амилазы слюны при различных значенияхpHсреды.

Порядок проведения эксперимента

В 7 однотипных пробирок пипетками наливают растворы лимонной кислоты и фосфорнокислого натрия, получая, таким образом, буферные смеси со значениями рН от 5,6 до 8,0. В каждую пробирку добавляют по 10 капель 1 % - ного раствора хлористого натрия, 0,5 % - ного раствора крахмала, разведенной в 100 раз слюны и перемешивают. Пробирки ставят на 10 мин в водяную баню при температуре 38° С, после чего быстро охлаждают, добавляют во все пробирки по 1 капле раствора йода, перемешивают и наблюдают окраску. Устанавливают, при каком рН произошло наиболее полное расщепление крахмала (желтая или буровато – желтая окраска с йодом). Реакция весьма специфична и показательна. Сделайте вывод об оптимальном значении рН для фермента амилазы.

Опыт 3. Специфичность ферментов

Ферменты отличаются от неорганических катализаторов необычайно высокой специфичностью. Начальным этапом каталитического акта является образование фермент-субстратного комплекса, т.е. связывание субстрата с каталитическим центром фермента. Пространственная конформация субстратного центра должна находиться в точном геометрическом соответствии со структурой молекулы субстрата. Только в этом случае возможно образование фермент-субстратного комплекса и осуществление каталитической функции фермента. Таки образом, сущность специфичности ферментов состоит в том, что субстрат подходит к ферменту как ключ к замку.

Принцип метода.Исследуется воздействие ферментов амилазы и сахаразы на различные субстраты – крахмал и сахарозу.

Порядок проведения эксперимента

В пробирки 1 и 2 наливают по 4 -5 мл раствора крахмала, в пробирки 3 и 4 – по 4 – 5 мл раствора сахарозы. В пробирки 1 и 3 добавляют по 2 – 3 мл разбавленной слюны (амилаза), а пробирки 2 и 4 – по 2 – 3 мл раствора сахаразы. Содержимое пробирок перемешивают и инкубируют 10 мин в термостате (37ºC). Затем в пробирки 1 и 2 добавляют по 1 капле реактива Люголя, в пробирки 3 и 4 – по 1 – 2 капли реактива Фелинга и нагревают. Наблюдения записывают в таблицу специфичности ферментов амилазы и сахаразы и делают выводы об их активности.

Таблица 3.

№ пробирки	Субстрат	Фермент	Инкубация	Окраска с йодом	Реакция Фелинга
1	Крахмал	Амилаза	10 мин, 37ºС
2	Крахмал	Сахараза	10 мин, 37ºС
3	Сахароза	Амилаза	10 мин, 37ºС
4	Сахароза	Сахараза	10 мин, 37ºС

Опыт 4. Влияние активаторов и ингибиторов

Регуляция деятельности ферментов осуществляется как в клетке, так и вне ее путем присоединения к молекуле фермента ряда низкомолекулярных веществ. Такие вещества могут служить положительными или отрицательными эффекторами. Положительные эффекторы, или активаторы, присоединяясь к молекуле неактивного предшественника, способны изменять ее конформацию с образованием соединения, обладающего каталитической активностью. Функцию активаторов часто выполняют ионы металлов и некоторые анионы. Угнетающее действие отрицательных эффекторов (ингибиторов) реализуется путем изменения нативной конформации фермента. Ингибиторами могут быть неорганические соли, метаболиты, гормоны. Место прикрепления эффектора к молекуле фермента называется аллостерическим центром.

Принцип действия. Исследуется активность амилазы слюны в присутствии соединений, обладающих свойствами положительных и отрицательных эффекторов.

Порядок проведения эксперимента

В 2 пробирки наливают по 4 – 5 мл раствора крахмала, в пробирку 1 добавляют 1 – 2 мл раствора хлорида натрия, в пробирку 2 – 1 -2 мл раствора сульфата меди. В обе пробирки приливают по 1 – 2 мл разбавленной слюны, содержимое пробирок перемешивают и пробирки инкубируют 10 мин в термостате (37ºC). Затем в обе пробирки добавляют по 1 капле реактива Люголя. Наблюдения заносят в таблицу, показывающую влияние хлорида натрия и сульфата меди на активность амилазы и делают выводы:

Таблица 4.

№ пробирки	Фермент	Эффектор	Субстрат	Инкубация	Окраска с йодом
1	амилаза	NaCl	крахмал	10 мин, 37ºС
2	амилаза	CuSO4	крахмал	10 мин, 37ºС

Контрольные вопросы и задания

1. Какие вещества называются ферментами?

2. Перечислите биологические функции ферментов.

3. В каких условиях ферменты способны выполнять функции катализаторов?

4. В чем заключается термолабильность ферментов?

5. Какой опыт доказывает специфичность действия ферментов?

6. Почему в растворе хлорида натрия фермент активен, а в растворе сульфата меди теряет свою активность?

Тема № 4. Углеводы. Структура, свойства и функции углеводов в организме человека. Качественные реакции на углеводы.

Углеводы относятся к полифункциональным соединениям, содержащим

O

׀ ׀

карбонильную — C— и гидроксильные -OH группы. Поэтому они одновременно обладают свойствами альдегидов или кетонов и многоатомных спиртов. Углеводы – обширная группа природных соединений, подразделяемых на простые (моносахариды) и сложные (олигосахариды и полисахариды).

Моносахариды в зависимости от числа углеродных атомов в молекуле, подразделяются на триозы, тетрозы, пентозы, гексозы, гептозы и т.д. Все природные моносахариды содержат в своих молекулах асимметрические атомы углерода, являются оптически и физиологически активными веществами.

Сложные углеводы - олигосахариды и полисахариды - при нагревании их с растворами кислот или ферментами, расщепляются на моносахариды. Олигосахариды при этом распадаются с образованием нескольких молекул моносахаридов (двух – дисахариды, трех – трисахариды, четырех – тетрасахариды и т.д.). Полисахариды при гидролизе образуют большое число молекул моносахаридов. Они имеют большую молекулярную массу, нерастворимы в воде или образуют в ней коллоидные растворы.

Углеводы широко распространены в природе, особенно в растительном мире. Они являются конечными продуктами фотосинтеза у зеленых растений. Животные, не обладающие способностью к подобной аккумуляции солнечной энергии, используют вещества, накопленные растениями.

Основные функции углеводов:

1. углеводы участвуют в построении живых структур;

2. служат материалом для биосинтеза соединений других классов;

3. им принадлежит важная роль в биоэнергетике клетки;

4. углеводы входят в состав нуклеиновых кислот, гликопротеидов, гликолипидов, некоторых витаминов и коферментов;

5. как составные компоненты гликопротеидов углеводы участвуют в образовании внешнего примембранного слоя, играющего большую роль в защите клеток от проникновения в них микроорганизмов и вирусов;

6. с ними связаны иммунохимические свойства тканей.

Качественные реакции на углеводы

В организме животных и человека наиболее часто встречаются глюкоза и галактоза. Углеводы, молекулы которых содержат свободные карбонильные группы, называются восстанавливающими. Эти сахара в щелочной среде способны окисляться, при этом восстанавливая медь из гидроксида меди (ІІ) в соли меди (І) или серебро из оксида серебра. На этом основан ряд методов качественного и количественного определения углеводов.

Цель:Изучить основные качественные реакции на углеводы.

Приборы и реактивы: Штатив с пробирками, водяная баня, 1 % - ный раствор глюкозы, 10 % - ный раствор гидроксида натрия, 1 % - ный раствор сульфата меди, 1 % - ный раствор фруктозы, реактив Селиванова ( 0,05 г резорцима растворяют в 100 мл 20 % - ного раствора хлороводородной кислоты), аммонийный раствор нитрата серебра, 1 %- ный раствор сахарозы, 2 % - ный раствор сульфата кобальта, 1 % - ный раствор крахмала, раствор Люголя, этиловый спирт, 1 % - ный раствор гликогена, кристаллический хлорид натрия.

Опыт 1. Проба с гидроксидом меди (ІІ) – реакция Троммера.

В щелочном растворе редуцирующие моно- и дисахариды восстанавливают гидроксид меди (ІІ) в оксид меди (І):

OO

׀׀t⁰ ׀׀

C₅H₁₁О₅—C—H+ 2Cu(OH)₂→C₅H₁₁ O₅—C—OH+Cu₂O+ 2H₂O

глюкоза глюконовая кислота

Порядок проведения эксперимента:

В пробирку наливают 1 – 2 мл раствора глюкозы, равный объем раствора гидроксида, и при встряхивании добавляют по каплям раствор сульфата меди. В присутствии глюкозы образующийся осадок гидроксида меди (II) растворяется, окрашивая жидкость в голубой цвет. Верхний слой жидкости нагревают до кипения. Появление желтого (гидроксид медиI), а затем красного (оксид медиI) осадка указывает на положительную реакцию Троммера.

Опыт 2. Обнаружение фруктозы в растворе ( реакция Селиванова).

Эта реакция применяется специально для распознавания кетоз; особенно хорошо идет она с фруктозой и теми сложными сахарами, которые при гидролизе дают фруктозу (сахароза, инулин). Реакция основана на образовании из фруктозы при нагревании с кислотой 5 – оксиметилфурфурола, который с резорцином (1,3 диоксибензолом) дает продукт конденсации красного цвета.

Порядок проведения эксперимента:

В пробирку наливают 1 – 2 мл реактива Селиванова, добавляют 2 – 3 капли раствора фруктозы и нагревают 1 2 мин в кипящей водяной бане. Наблюдают окрашивание жидкости в красный цвет.

Опыт 3. Реакция «серебряного зеркала».

К 1 мл 1 % -ного раствора нитрата серебра добавляют 3 мл концентрированного раствора гидроксида аммония, затем полученный раствор (реактив Толлекса) добавляют 1 мл 1% -ного раствора глюкозы. Нагревают на водяной бане до появления блестящего налета на внутренней поверхности стеклянной пробирки.

Опыт 4. Реакция на сахарозу.

Сахароза – невосстанавливающий дисахарид, при гидролизе (кислотном или ферментативном) ее молекула распадается на глюкозу и сахарозу. Сахароза с сульфатом кобальта в щелочной среде комплекс, окрашенный в фиолетовый цвет.

Порядок проведения эксперимента:

В пробирку наливают 2 – 3 мл раствора сахарозы, приливают несколько капель раствора сульфата кобальта. При приливании избытка раствора щелочи (1 мл) жидкость окрашивается в фиолетовый цвет.

Опыт 5. Цветные реакции на крахмал.

Крахмал – конечный продукт фотохимического синтеза, идущего в зеленых листьях, запасной полисахарид. Для животного организма крахмал является важным пищевым веществом. Крахмал – неоднородное вещество. Он состоит из двух фракций: амилозы (10 – 20 %) и амилопектина (80 – 90 %). Амилоза имеет вытянутую линейную неветвящуюся форму молекулы, растворима в воде. Цепи амилопектина сильно разветвлены. Амилопектин в воде набухает и дает клейстер.

Характерная реакция на крахмал – появление синего окрашивания от раствора йода в йодиде калия. Йодная реакция полисахаридов, в частности крахмала, - сложный процесс. Возникающая окраска зависит от строения полисахарида. В ходе реакции образуется комплексное соединение полисахарида с йодом. Этот процесс отчетливо выражен у амилозы. Для полисахаридов с разветвленными цепями, например амилопектина и гликогена, наряду с процессом образования комплексного соединения большое значение имеет и процесс адсорбции йода на поверхности ветвистых молекул.

Порядок проведения эксперимента:

В пробирку наливают 2 – 3 мл раствора крахмала, приливают 1 каплю раствора Люголя. Жидкость окрашивается в синий цвет. Содержимое пробирки делят на три части: к первой части прибавляют 1 – 2 мл раствора гидроксида натрия, ко второй – 2 -3 мл этилового спирта, третью часть нагревают. Во всех случаях окраска исчезает. В третьей пробе окраска вновь появляется при охлаждении, что свидетельствует о том, пробу с йодом необходимо проводить только с холодным раствором крахмала. Благодаря непрочности адсорбированного комплекса йода с крахмалом эта реакция чувствительна к присутствию спирта, к нагреванию и действию едких щелочей, с которыми йод образует гипойодиты.

Опыт 6. Реакция гликогена с йодом.

Гликоген служит основной запасной формой углеводов в животном организме. Он откладывается почти во всех органах и тканях. Главное депо гликогена – печень (2 – 5 %) и мышцы (0,5 – 2 %), в которых сосредоточено до 60 % его содержания в организме.

Гликоген по химическому строению сходен с амилопектином. Как и крахмал, гликоген при гидролизе дает ряд промежуточных продуктов – декстринов, затем дисахарид мальтозу, и наконец, моносахарид глюкозу. От прибавления йода раствор гликогена окрашивается в красно - бурый цвет различной интенсивности и оттенков, что зависит от структуры гликогена, которая неодинакова у разных видов животных и определяется степенью ветвления макромолекулы.

Порядок проведения эксперимента:

В пробирку наливают 2 – 3 мл раствора гликогена, добавляют 1 – 2 капли раствора Люголя, перемешивают, появляется красно – бурое окрашивание. Окраска усиливается при добавлении нескольких кристалликов хлорида натрия, но исчезает при добавлении раствора гидроксида натрия или нагревании.

Опыт 7. Обнаружение углеводов в продуктах питания.

Порядок проведения эксперимента:

1) К 1 – 2 мл раствора меда добавляют 5 – 6 мл раствора щелочи, а затем 5 – 6 капель 2% - ного раствора сульфата меди. Выпавший осадок Cu(OH)₂ голубого цвета сразу растворяется с образованием ярко – синего раствор, который при нагревании образует красный осадок Cu₂O. Опыт доказывает наличие в меде глюкозы и фруктозы.

2) На небольшие кусочки белого хлеба и картофеля наносят 1 каплю раствора

Люголя. Сразу появляется синее окрашивание. Опыт доказывает наличие в этих продуктах питания крахмала.

Контрольные вопросы и задания

1. Назовите основные функции углеводов в организме.

2. Перечислите основные группы углеводов.

3. Запишите формулы глюкозы, фруктозы.

4. Составьте уравнения реакций образования следующих дисахаридов: сахарозы, лактозы, мальтозы, целлобиозы.

5. Почему при длительной физической нагрузке рекомендуется съесть кусочек сахара?

6. Что такое «мышечная боль» с биохимической точки зрения?

Тема № 5. Липиды. Исследование структуры,

свойств и функций липидов.

Липидами называют многочисленную группу веществ, построенных по принципу сложных эфиров и характеризующихся растворимостью в органических растворителях и нерастворимостью в воде. К ним относятся глицериды (жиры), воска, стеролы и стериды, фосфолипиды и гликолипиды (цереброзиды, ганглиозиды). Липиды играют очень важную роль в качестве структурных компонентов клеточных мембран, источника энергии, растворителя органических веществ и предшественника других компонентов клетки (витамины группы D, желчные кислоты и гормоны стероидной природы).

В организме животных почти все липиды находятся в комплексе с белками, углеводами и другими соединениями. Комплексам придается большое значение в осуществлении ряда важнейших функций. Так, липопротеидами богаты митохондрии – структурные элементы клеток, в которых протекают процессы свободного и фосфорилирующего окисления и значительная часть процессов промежуточного обмена.

Глицериды (жиры)

Жиры представляют собой сложные эфиры трехатомного спирта глицерина и остатков высших жирных кислот:

O

׀׀

CH₂ —O—C—R₁

O

׀ ׀

CH — O — C —R₂

O

׀ ׀׀

CH₂ — O — C — R ₃

В состав молекулы природного жира обычно входят остатки насыщенных (пальмитиновая и стеариновая) и ненасыщенных (олеиновая, линолевая и другие) жирных кислот. В организме животных глицериды преимущественно смешанные и только 2-3 % их являются простыми (трипальмитат, тристеарат, триолеат).

Как правило, все природные жиры (свиное сало, коровье масло, растительные масла) являются сложной смесью различных глицеридов, белков, свободных жирных кислот, витаминов, каротиноидов и пигментов.

Основные функции жиров:

1. имеют большое значение для организма как один из источников энергии (резервный жир);

2. служат структурными компонентами протоплазмы клеток (структурный жир);

3. участвуют в терморегуляции организма;

4. предохраняют органы, нервы и сосуды от механических повреждений;

5. способствуют усвоению жирорастворимых витаминов A,D,EиKи других биологически активных веществ.

Содержащиеся в жирах ненасыщенные жирные кислоты – олеиновая, линолевая, линоленовая, арахидоновая – необходимы для регулирования окислительно - восстановительных процессов в клетках, а также для биосинтеза простагландинов – гормонов, обладающих широким биологическим действием.

Качественные реакции на жиры

Цель: изучить строение и свойства липидов, их роль в организме.

Приборы и реактивы:часовое стекло или пластинки стеклянные, штатив с пробирками, химический стакан, воронки, фильтры бумажные, палочка стеклянная, 0,2 % -ный раствор Судана (приготовление: к 200 мг СуданаIIIдобавляют 100 мл 70 % - ного этилового спирта, нагретого на водяной бане, перемешивают и оставляют стоять не менее суток), растительное масло, этиловый спирт, бензол, хлороформ, желчь, разведенная в два раза, раствор белка, 1 % - ный раствор мыла, 1% - ный раствор гидрокарбоната натрия, лецитин (приготовление: в стакан помещают половину яичного желтка, добавляют 20 мл горячего 96% - ного спирта и перемешивают стеклянной палочкой, смесь охлаждают и фильтруют в сухую пробирку, и если фильтрат непрозрачный, фильтрование повторяют), ацетон.

Опыт 1. Реакция жира и масла с Суданом III

Порядок проведения эксперимента:

На часовое стекло наносят каплю масла, добавляют каплю Судана IIIи размешивают. Наблюдают появление оранжевого цвета смеси.

Краситель Судан IIIприменяется в гистологических исследованиях для выявления жиров в тканях.

Опыт 2. Растворимость жиров

Порядок проведения эксперимента:

В четыре пробирки помещают 5 – 7 капель подсолнечного масла. В первую пробирку добавляют 2 мл воды, во вторую – 2 мл спирта, в третью – 2 мл бензола и в четвертую – 2 мл хлороформа. Смесь в пробирках хорошо встряхивают, отмечая наблюдаемые изменения. В первой пробирке образуется нестойкая, быстро расслаивающаяся эмульсия, во второй – мутный раствор, что указывает на плохую растворимость масла в спирте; в третьей и четвертой пробирках образуются прозрачные растворы в результате хорошей растворимости масла в бензоле и хлороформе.

Опыт 3. Эмульгирование жиров.

Ферменты желудочно – кишечного тракта расщепляют только те жиры, которые находятся в эмульгированном состоянии. В желудочно – кишечном тракте есть условия для превращения жиров в эмульсию, а основными ее стабилизаторами (эмульгаторами) являются соли желчных кислот, белки, фосфолипиды, мыла и гидрокарбонаты щелочных металлов. Молекулы эмульгаторов адсорбируются (оседают) в наружном слое жировых капелек и резко понижают поверхностное натяжение на границе раздела фаз, в результате чего увеличивается устойчивость эмульсии. При этом гидрофильные группы эмульгаторов находятся в водной фазе, а гидрофобные растворяются в жире, способствуя его дроблению на мелкие капли – эмульгированию.

Порядок проведения эксперимента:

Берут шесть пробирок. В первую и во вторую пробирку наливают по 1 мл воды, в третью – 1 мл желчи, в четвертую – 1 мл раствора белка, в пятую – 1 мл раствора мыла, в шестую – 1 мл раствора гидрокарбоната натрия. Во вторую пробирку вносят немного лецитина. В каждую пробирку добавляют по 5 капель подсолнечного масла, энергично их встряхивают и оставляют на 5 мин. Во всех пробирках, кроме первой, образуется стойкая эмульсия.

Фосфолипиды

Фосфолипиды – одна из важнейших групп жироподобных веществ, широко распространенных в клетках тканей животных организмов. Они представляют собой высокомолекулярные сложные эфиры, в состав которых входят спирты разных классов, предельные и непредельные жирные кислоты, фосфорная кислота и азотистые вещества.

В зависимости от азотистого основания и спирта их разделяют на следующие подгруппы: холинфосфолипиды (лецитины), коламинфосфолипиды (кефалины), серинфосфолипиды, ацетальфосфолипиды, сфингомиелины и инозитфосфолипиды. Первые четыре фосфолипида построены из спирта глицерина, остатков предельных и непредельных жирных кислот (альдегида кислоты, например стеаральальдегида), фосфорной кислоты и какого-либо основания. Общая формула их следующая:

O

׀׀

CH₂ —O—C—R₁

O

׀ ׀

CH—O—C—R₂

O

׀ ׀׀

CH₂—O—P—O—X(азотистое основание)

׀

OH

Фосфолипиды наряду с белками являются главными компонентами мембран клеток и их органелл (плазмалемма, митохондрии, экзоплазматическая сеть, пластинчатый комплекс Гольджи, лизосомы и др.). Они принимают участие в обмене веществ (транспорт через мембраны, субстраты тканевого дыхания).

Фосфолипиды различаются способностью растворяться в органических растворителях. Из клеток и тканей фосфолипиды лучше всего экстрагируются смесью хлороформа со спиртом. Большинство фосфолипидов плохо растворимо в ацетоне, что используется при препаративном выделении их из биологических объектов.

Выделение фосфолипидов

Опыт 4. Выделение лецитинов из яичного желтка.

Порядок проведения эксперимента:

Для выявления в фильтрате лецитина в сухую пробирку наливают 5 мл ацетона и к нему по каплям добавляют полученный фильтрат. Появление мути свидетельствует об осаждении лецитина. В другую сухую пробирку наливают 3 мл фильтрата и добавляют к нему каплями воду. Образуется стойкая эмульсия.

Стеролы и стериды

Стеролы и стериды составляют большую группу соединений, широко распространенных в организме животных и человека.

Стеролы – одноатомные вторичные циклические спирты, структурную основу которых составляет циклопентанопергидрофенантрен. К ним относятся холестерол, эргостерол, копростерол и другие вещества, различающиеся преимущественно строением боковой цепи и наличием двойных связей в ядре фенантрена. Из стеролов в тканях животных наиболее распространен холестерол. Много его содержится в нервной ткани, особенно в белом веществе головного мозга, а также в желчи, сперме, ланолине.

Холестерол – важнейший структурный компонент клеток; он служит исходным веществом при биосинтезе стероидных гормонов, витаминов группы D, желчных кислот и других биологически важных соединений.

Холестерол содержится в тканях преимущественно в форме сложных комплексов с белками и фосфолипидами, а также в виде сложных эфиров пальмитиновой, стеариновой, олеиновой и других кислот. Сложные эфиры холестерола и высших жирных кислот называют стеридами (холестеридами).

Подобно жирам холестерол нерастворим в воде, но легко экстрагируется из клеток хлороформом, эфиром, бензолом, сероуглеродом или горячим спиртом. Холестерол кристаллизуется из спирта в виде тонких бесцветных пластинок, а из эфира – в виде игл. Плавится он при 150 ºC.